Tecnologias de Genotipagem e Sequenciamento

As tecnologias de genotipagem e sequenciamento são os métodos laboratoriais que detectam a variação genética relatada por um teste farmacogenômico. Elas variam desde ensaios direcionados que interrogam uma lista fixa de variantes conhecidas até o sequenciamento de próxima geração que lê trechos de DNA base por base. A escolha da plataforma determina quais variantes podem ser encontradas, como alelos raros ou estruturalmente complexos são tratados e, portanto, quão completamente o perfil farmacogenético de um paciente pode ser caracterizado.

Definition

As tecnologias de genotipagem e sequenciamento são os métodos analíticos usados para detectar a variação herdada do DNA em farmacogenes, compreendendo ensaios de genotipagem direcionados que testam variantes predefinidas e métodos de sequenciamento que leem a sequência subjacente do DNA para identificar variantes conhecidas e novas.

Scope

Esta entrada abrange as principais classes de tecnologia de detecção usadas em laboratórios farmacogenômicos: genotipagem direcionada de variantes de nucleotídeo único (arrays e ensaios alelo-específicos) e abordagens de sequenciamento, incluindo Sanger e sequenciamento de próxima geração. Ela explica por que os painéis de genotipagem detectam apenas variantes pré-especificadas, enquanto o sequenciamento pode descobrir variantes novas e complexas, e por que farmacogenes complexos como o CYP2D6 desafiam todas as plataformas. É uma descrição de referência de métodos, não um protocolo laboratorial ou um guia para solicitação de testes.

Core questions

• Qual a diferença entre genotipagem direcionada e sequenciamento, e o que cada um detecta?
• Por que os painéis de genotipagem relatam apenas um conjunto limitado de variantes?
• Como as plataformas de sequenciamento lidam com variantes farmacogenéticas novas ou raras?
• Por que genes como o CYP2D6 são tecnicamente difíceis de tipar com precisão?

Key concepts

• Genotipagem direcionada versus sequenciamento não direcionado
• Arrays de variantes de nucleotídeo único
• Sequenciamento de próxima geração
• Sequenciamento de Sanger
• Chamada de alelo-estrela e diplotipo
• Variação estrutural e número de cópias em farmacogenes
• Cobertura analítica e as variantes que um painel não detecta

Mechanisms

Os ensaios de genotipagem direcionados testam uma amostra de DNA para um conjunto predeterminado de posições variantes, tipicamente variantes de nucleotídeo único comuns e bem caracterizadas e alterações estruturais selecionadas; eles são rápidos e baratos, mas relatam apenas as variantes que foram projetados para detectar. O sequenciamento, por outro lado, lê a sequência de nucleotídeos das regiões-alvo, podendo identificar variantes estabelecidas e previamente não observadas, incluindo alelos raros que os painéis direcionados omitem (Tafazoli et al., 2021; Roden, 2019). As variantes detectadas são mapeadas para definições padronizadas de alelos-estrela e combinadas em um diplotipo; o Consórcio de Variação de Farmacogenes (Pharmacogene Variation Consortium) mantém as definições de alelos de referência que tornam esse mapeamento consistente entre os laboratórios (Gaedigk et al., 2017; Gaedigk et al., 2021). Genes altamente polimórficos e estruturalmente variáveis, como o CYP2D6, que podem carregar deleções, duplicações e alelos híbridos, permanecem tecnicamente desafiadores para todas as plataformas.

Clinical relevance

A plataforma que um laboratório utiliza molda o que um resultado farmacogenômico pode afirmar: um resultado normal de genotipagem direcionada significa apenas que as variantes testadas estavam ausentes, não que o gene está livre de toda variação. Reconhecer essa distinção faz parte da avaliação de um relatório farmacogenômico. Esta entrada descreve como a variação é detectada e não é um guia para selecionar, solicitar ou agir com base em um teste específico.

Evidence & guidelines

As definições de alelos de referência usadas para interpretar a saída de genotipagem e sequenciamento são curadas pelo Consórcio de Variação de Farmacogenes (Pharmacogene Variation Consortium), que padroniza a nomenclatura de alelos-estrela em farmacogenes (Gaedigk ets al., 2017; Gaedigk et al., 2021). Revisões do sequenciamento de próxima geração em farmacogenômica clínica descrevem a cobertura comparativa e as limitações das plataformas (Tafazoli et al., 2021). Estas são referências metodológicas, e não padrões prescritivos de cuidado.

History

A detecção farmacogenômica começou com ensaios de gene único e sequenciamento de Sanger, expandindo-se então com arrays de variantes de nucleotídeo único de alto rendimento que permitiram a tipagem de muitas variantes de uma só vez. A chegada do sequenciamento de próxima geração tornou viável a leitura de farmacogenes inteiros e a descoberta de alelos raros e novos, deslocando o campo de testar apenas variantes conhecidas comuns para uma caracterização mais completa (Tafazoli et al., 2021; Roden, 2019). Paralelamente, a consolidação da nomenclatura de alelos sob o Consórcio de Variação de Farmacogenes (Pharmacogene Variation Consortium) deu ao campo uma referência comum para nomear o que essas tecnologias detectam (Gaedigk et al., 2017).

Debates

Genotipagem direcionada versus sequenciamento para testes clínicos

Os painéis direcionados são mais baratos e rápidos, mas perdem variantes raras e novas, enquanto o sequenciamento é mais completo, mas mais caro e complexo de interpretar; o equilíbrio apropriado para testes farmacogenômicos de rotina ainda é discutido.

Key figures

• Andrea Gaedigk
• Magnus Ingelman-Sundberg
• Teri E. Klein
• Dan M. Roden

Seminal works

• gaedigk-2017
• tafazoli-2021
• roden-2019

Frequently asked questions

Um resultado de genotipagem normal significa que o paciente não possui variantes relevantes?

Não necessariamente. A genotipagem direcionada detecta apenas as variantes específicas para as quais foi projetada, portanto, um resultado normal exclui essas variantes, mas não pode excluir variantes raras ou novas que apenas o sequenciamento encontraria.

Por que o CYP2D6 é considerado difícil de genotipar?

O CYP2D6 é altamente polimórfico e propenso a alterações estruturais, como deleções, duplicações e alelos híbridos, que são tecnicamente difíceis de detectar e resolver com precisão em muitas plataformas.