Tecnologías de Genotipado y Secuenciación

Las tecnologías de genotipado y secuenciación son los métodos de laboratorio que detectan la variación genética que reporta una prueba farmacogenómica. Estas abarcan desde ensayos dirigidos que interrogan una lista fija de variantes conocidas hasta la secuenciación de próxima generación que lee tramos de ADN base por base. La elección de la plataforma determina qué variantes se pueden encontrar, cómo se manejan los alelos raros o estructuralmente complejos y, por lo tanto, cuán completamente se puede caracterizar el perfil farmacogenético de un paciente.

Definition

Las tecnologías de genotipado y secuenciación son los métodos analíticos utilizados para detectar la variación heredada del ADN en farmacogenes, que comprenden ensayos de genotipado dirigidos que prueban variantes predefinidas y métodos de secuenciación que leen la secuencia de ADN subyacente para identificar variantes tanto conocidas como novedosas.

Scope

Esta entrada cubre las principales clases de tecnología de detección utilizadas en laboratorios farmacogenómicos: genotipado dirigido de variantes de un solo nucleótido (matrices y ensayos alelo-específicos) y enfoques de secuenciación que incluyen Sanger y secuenciación de próxima generación. Se explica por qué los paneles de genotipado detectan solo variantes preespecificadas, mientras que la secuenciación puede descubrir variantes novedosas y complejas, y por qué los farmacogenes complejos como CYP2D6 representan un desafío para todas las plataformas. Es una descripción de referencia de los métodos, no un protocolo de laboratorio ni una guía para la solicitud de pruebas.

Core questions

• ¿Cuál es la diferencia entre el genotipado dirigido y la secuenciación, y qué detecta cada uno?
• ¿Por qué los paneles de genotipado reportan solo un conjunto limitado de variantes?
• ¿Cómo manejan las plataformas de secuenciación las variantes farmacogenéticas novedosas o raras?
• ¿Por qué genes como CYP2D6 son técnicamente difíciles de tipificar con precisión?

Key concepts

• Genotipado dirigido versus secuenciación no dirigida
• Matrices de variantes de un solo nucleótido
• Secuenciación de próxima generación
• Secuenciación Sanger
• Llamada de alelo estrella y diplotipo
• Variación estructural y número de copias en farmacogenes
• Cobertura analítica y las variantes que un panel omite

Mechanisms

Los ensayos de genotipado dirigidos analizan una muestra de ADN en busca de un conjunto predeterminado de posiciones de variantes, típicamente variantes de un solo nucleótido comunes y bien caracterizadas, y cambios estructurales seleccionados; son rápidos y económicos, pero solo reportan las variantes para las que están diseñados. La secuenciación, en cambio, lee la secuencia de nucleótidos de las regiones objetivo, por lo que puede identificar variantes tanto establecidas como previamente no observadas, incluyendo alelos raros que los paneles dirigidos omiten (Tafazoli et al., 2021; Roden, 2019). Las variantes detectadas se mapean a definiciones estandarizadas de alelos estrella y se combinan en un diplotipo; el Consorcio de Variación de Farmacogenes (Pharmacogene Variation Consortium) mantiene las definiciones de alelos de referencia que hacen que este mapeo sea consistente entre laboratorios (Gaedigk et al., 2017; Gaedigk et al., 2021). Los genes altamente polimórficos y estructuralmente variables como CYP2D6, que pueden portar deleciones, duplicaciones y alelos híbridos, siguen siendo técnicamente exigentes para todas las plataformas.

Clinical relevance

La plataforma que utiliza un laboratorio determina lo que un resultado farmacogenómico puede afirmar: un resultado normal de genotipado dirigido significa solo que las variantes analizadas estaban ausentes, no que el gen esté libre de toda variación. Reconocer esta distinción es parte de la evaluación de un informe farmacogenómico. Esta entrada describe cómo se detecta la variación y no es una guía para seleccionar, solicitar o actuar sobre una prueba específica.

Evidence & guidelines

Las definiciones de alelos de referencia utilizadas para interpretar los resultados de genotipado y secuenciación son curadas por el Consorcio de Variación de Farmacogenes (Pharmacogene Variation Consortium), que estandariza la nomenclatura de alelos estrella en todos los farmacogenes (Gaedigk et al., 2017; Gaedigk et al., 2021). Las revisiones de la secuenciación de próxima generación en farmacogenómica clínica describen la cobertura comparativa y las limitaciones de las plataformas (Tafazoli et al., 2021). Estas son referencias metodológicas más que estándares prescriptivos de atención.

History

La detección farmacogenómica comenzó con ensayos de un solo gen y secuenciación Sanger, luego se expandió con matrices de variantes de un solo nucleótido de alto rendimiento que permitieron tipificar muchas variantes a la vez. La llegada de la secuenciación de próxima generación hizo factible leer farmacogenes completos y descubrir alelos raros y novedosos, cambiando el campo de probar solo variantes conocidas comunes hacia una caracterización más completa (Tafazoli et al., 2021; Roden, 2019). Paralelamente, la consolidación de la nomenclatura de alelos bajo el Consorcio de Variación de Farmacogenes (Pharmacogene Variation Consortium) proporcionó al campo una referencia común para nombrar lo que estas tecnologías detectan (Gaedigk et al., 2017).

Debates

Genotipado dirigido versus secuenciación para pruebas clínicas

Los paneles dirigidos son más económicos y rápidos, pero omiten variantes raras y novedosas, mientras que la secuenciación es más completa pero más costosa y compleja de interpretar; el equilibrio adecuado para las pruebas farmacogenómicas de rutina aún se debate.

Key figures

• Andrea Gaedigk
• Magnus Ingelman-Sundberg
• Teri E. Klein
• Dan M. Roden

Seminal works

• gaedigk-2017
• tafazoli-2021
• roden-2019

Frequently asked questions

¿Significa un resultado de genotipado normal que un paciente no tiene variantes relevantes?

No necesariamente. El genotipado dirigido detecta solo las variantes específicas para las que está diseñado, por lo que un resultado normal descarta esas variantes, pero no puede excluir las raras o novedosas que solo la secuenciación encontraría.

¿Por qué se considera difícil de genotipar a CYP2D6?

CYP2D6 es altamente polimórfico y propenso a cambios estructurales como deleciones génicas, duplicaciones y alelos híbridos, los cuales son técnicamente difíciles de detectar y resolver con precisión en muchas plataformas.