การวิเคราะห์เชิงปริมาณแบบเรียลไทม์และการประเมินจำนวนสำเนา

วิธีการทางโมเลกุลเชิงปริมาณจะวัดปริมาณของกรดนิวคลีอิกเป้าหมายที่มีอยู่ แทนที่จะเป็นเพียงแค่ว่าสามารถตรวจจับได้หรือไม่ การทำปฏิกิริยา PCR เชิงปริมาณแบบเรียลไทม์จะติดตามการเพิ่มจำนวนในขณะที่เกิดขึ้น การทำปฏิกิริยา PCR แบบดิจิทัลจะแบ่งตัวอย่างเพื่อให้นับโมเลกุลได้อย่างสมบูรณ์ และการประเมินจำนวนสำเนาจะพิจารณาว่าบริเวณจีโนมมีการเพิ่มขึ้นหรือสูญหายไปหรือไม่

Definition

การวิเคราะห์เชิงปริมาณแบบเรียลไทม์จะวัดปริมาณของกรดนิวคลีอิกเป้าหมาย โดยทั่วไปจะทำโดยการติดตามสัญญาณฟลูออเรสเซนต์ระหว่างการเพิ่มจำนวน (real-time PCR) หรือโดยการนับส่วนที่ให้ผลบวก (digital PCR); การประเมินจำนวนสำเนาจะพิจารณาจำนวนสำเนาของบริเวณจีโนมเมื่อเทียบกับข้อมูลอ้างอิง

Scope

หัวข้อนี้ครอบคลุมถึง PCR แบบเรียลไทม์ (เชิงปริมาณ), PCR แบบดิจิทัลและดรอปเล็ตดิจิทัล, และแนวทางในการประเมินจำนวนสำเนา โดยกล่าวถึงหลักการของการหาปริมาณและข้อควรพิจารณาที่ทำให้ผลลัพธ์เปรียบเทียบกันได้ ซึ่งนำเสนอในรูปแบบของเอกสารอ้างอิงทางระเบียบวิธีวิจัยมากกว่าคำแนะนำในการทดสอบทางคลินิก

Key concepts

• Real-time (quantitative) PCR
• รอบการหาปริมาณ (Cq) และประสิทธิภาพการเพิ่มจำนวน
• กราฟมาตรฐานและการหาปริมาณแบบสัมพัทธ์
• Digital และ droplet digital PCR
• การหาปริมาณที่แน่นอนโดยการแบ่งส่วน
• การเพิ่มขึ้นและการสูญหายของจำนวนสำเนา
• มาตรฐานการรายงานและการทำซ้ำได้

Mechanisms

Real-time PCR จะเชื่อมโยงการเพิ่มจำนวนเข้ากับสารเรืองแสงที่สัญญาณจะเพิ่มขึ้นตามสัดส่วนของการสะสมของผลิตภัณฑ์; รอบที่สัญญาณข้ามเกณฑ์สะท้อนถึงปริมาณเริ่มต้นของเป้าหมาย ทำให้สามารถหาปริมาณแบบสัมพัทธ์หรือแบบใช้กราฟมาตรฐานได้ (Heid et al., 1996) Digital PCR จะกระจายตัวอย่างออกเป็นส่วนเล็กๆ จำนวนมาก เพื่อให้แต่ละส่วนมีโมเลกุลศูนย์หรือเพียงไม่กี่โมเลกุล; การนับสัดส่วนของส่วนที่ให้ผลบวกและการใช้สถิติปัวซงจะให้จำนวนที่แน่นอนโดยไม่ต้องใช้กราฟมาตรฐาน (Hindson et al., 2011) การประเมินจำนวนสำเนาจะเปรียบเทียบปริมาณของบริเวณเป้าหมายกับข้อมูลอ้างอิงเพื่อตรวจจับการเพิ่มจำนวนหรือการลบ ซึ่งเป็นแนวคิดที่บุกเบิกโดยการผสมพันธุ์จีโนมเชิงเปรียบเทียบ (Kallioniemi et al., 1992)

Clinical relevance

วิธีการเชิงปริมาณและจำนวนสำเนาถูกนำมาใช้ในการวัดปริมาณเชื้อโรค การแสดงออกของยีน และการเพิ่มขึ้นหรือลดลงของจีโนม บทความนี้อธิบายว่าการหาปริมาณทำงานอย่างไรในฐานะเอกสารอ้างอิงทางระเบียบวิธีวิจัย; ไม่ได้ให้คำแนะนำในการเลือก การตีความ หรือการดำเนินการใดๆ เกี่ยวกับการทดสอบเชิงปริมาณเฉพาะในการดูแลผู้ป่วย

Evidence & guidelines

การรายงานผลของ quantitative PCR ได้รับการชี้นำโดยคำแนะนำ MIQE ซึ่งระบุข้อมูลขั้นต่ำที่จำเป็นสำหรับการตีพิมพ์ที่ทำซ้ำได้ (Bustin et al., 2009) การศึกษาเบื้องต้นที่สำคัญได้อธิบายถึงการหาปริมาณแบบเรียลไทม์ (Heid et al., 1996), การหาปริมาณแบบดิจิทัลที่แน่นอน (Hindson et al., 2011), และการวัดจำนวนสำเนาทั่วทั้งจีโนม (Kallioniemi et al., 1992)

History

Real-time PCR ในช่วงกลางทศวรรษ 1990 ได้เปลี่ยนการเพิ่มจำนวนจากเครื่องมือเชิงคุณภาพไปสู่เครื่องมือเชิงปริมาณ (Heid et al., 1996) และมาตรฐานการรายงานที่เป็นที่ยอมรับก็เกิดขึ้นในอีกหนึ่งทศวรรษต่อมา (Bustin et al., 2009) Digital PCR โดยเฉพาะอย่างยิ่ง droplet digital PCR ได้ช่วยให้สามารถนับโมเลกุลได้อย่างแม่นยำสูง (Hindson et al., 2011) ในขณะที่การประเมินจำนวนสำเนาได้พัฒนาจากการผสมพันธุ์จีโนมเชิงเปรียบเทียบไปสู่ระเบียบวิธีที่ใช้ array และการจัดลำดับ (Kallioniemi et al., 1992)

Key figures

• Christian Heid
• Stephen Bustin
• Benjamin Hindson

Seminal works

• heid-1996
• hindson-2011
• bustin-2009

Frequently asked questions

Digital PCR แตกต่างจาก real-time quantitative PCR อย่างไร?

Real-time PCR ประมาณปริมาณเริ่มต้นของเป้าหมายจากระยะเวลาที่สัญญาณฟลูออเรสเซนต์ข้ามเกณฑ์ โดยปกติจะเทียบกับมาตรฐาน ในขณะที่ digital PCR จะแบ่งตัวอย่างและนับช่องที่ให้ผลบวกเพื่อให้ได้จำนวนโมเลกุลที่แน่นอนโดยไม่ต้องใช้กราฟมาตรฐาน

การประเมินจำนวนสำเเนาวัดอะไร?

เป็นการพิจารณาว่ามีสำเนาของบริเวณจีโนมเฉพาะอยู่กี่สำเนาเมื่อเทียบกับข้อมูลอ้างอิง โดยระบุการเพิ่มจำนวน (gains) หรือการลบ (losses) ของบริเวณนั้น