การประยุกต์ใช้ Real-Time PCR และ Quantitative PCR

Real-time PCR หรือที่เรียกว่า quantitative PCR (qPCR) เป็นวิธีการวัดการสะสมของดีเอ็นเอที่ถูกเพิ่มปริมาณในแต่ละรอบผ่านสัญญาณเรืองแสง ซึ่งช่วยให้สามารถประมาณปริมาณเริ่มต้นของลำดับเป้าหมายได้ เมื่อใช้ร่วมกับการถอดรหัสย้อนกลับ (RT-qPCR) ถือเป็นหนึ่งในวิธีการที่ใช้กันอย่างแพร่หลายที่สุดสำหรับการหาปริมาณการแสดงออกของยีนในพยาธิวิทยาโมเลกุล

Definition

Real-time quantitative PCR เป็นวิธีการเพิ่มปริมาณกรดนิวคลีอิกที่ติดตามการก่อตัวของผลิตภัณฑ์แบบเรียลไทม์ผ่านการเรืองแสง โดยใช้รอบการหาปริมาณเพื่อประมาณปริมาณเริ่มต้นของดีเอ็นเอ หรือ (หลังจากการถอดรหัสย้อนกลับ) อาร์เอ็นเอเป้าหมาย

Scope

หัวข้อนี้ครอบคลุมหลักการวัดของ real-time PCR, รอบการหาปริมาณ (Cq) และความสัมพันธ์กับปริมาณแม่แบบ, การหาปริมาณสัมพัทธ์ด้วยวิธี 2-DDCT แบบเปรียบเทียบ, บทบาทของยีนอ้างอิงและประสิทธิภาพการเพิ่มปริมาณ, และมาตรฐานการรายงานที่ควบคุมความสามารถในการทำซ้ำ นอกจากนี้ยังกล่าวถึง digital PCR ในฐานะแนวทางการหาปริมาณสัมบูรณ์ที่เกี่ยวข้อง โดยจะกล่าวถึงสิ่งเหล่านี้ในฐานะวิธีการทางห้องปฏิบัติการ ไม่ใช่โปรโตคอลการทดสอบทางคลินิก

Core questions

• รอบการหาปริมาณมีความสัมพันธ์กับปริมาณแม่แบบเริ่มต้นอย่างไร?
• การแสดงออกสัมพัทธ์คำนวณและปรับให้เป็นมาตรฐานใน RT-qPCR ได้อย่างไร?
• เหตุใดประสิทธิภาพการเพิ่มปริมาณและการเลือกยีนอ้างอิงจึงส่งผลต่อผลลัพธ์?
• Digital PCR แตกต่างจาก real-time PCR ในการหาปริมาณอย่างไร?

Key concepts

• รอบการหาปริมาณ (Cq / Ct)
• ประสิทธิภาพการเพิ่มปริมาณ
• วิธี 2-DDCT แบบเปรียบเทียบ
• ยีนอ้างอิง (housekeeping genes)
• Reverse-transcription qPCR
• Digital PCR และการแบ่งส่วน
• มาตรฐานการรายงาน MIQE

Mechanisms

ในระหว่าง PCR ลำดับเป้าหมายจะเพิ่มขึ้นเป็นสองเท่าในแต่ละรอบในระยะเอ็กซ์โพเนนเชียล และสารเรืองแสงรายงาน (สีย้อมที่แทรกตัวหรือโพรบที่จำเพาะต่อลำดับ) จะปล่อยสัญญาณที่แปรผันตามสัดส่วนของผลิตภัณฑ์ที่สะสม รอบที่การเรืองแสงข้ามเกณฑ์ที่กำหนด (รอบการหาปริมาณ, Cq หรือ Ct) มีความสัมพันธ์ผกผันกับลอการิทึมของปริมาณแม่แบบเริ่มต้น ดังนั้น Cq ที่ต่ำกว่าหมายถึงเป้าหมายที่มากขึ้น การแสดงออกสัมพัทธ์มักจะคำนวณด้วยวิธี 2-DDCT แบบเปรียบเทียบ ซึ่งปรับ Cq ของเป้าหมายให้เป็นมาตรฐานด้วยยีนอ้างอิงและตัวอย่างสอบเทียบ โดยสมมติว่าประสิทธิภาพการเพิ่มปริมาณใกล้เคียงกัน (Livak & Schmittgen, 2001) เนื่องจากประสิทธิภาพ ความเสถียรของยีนอ้างอิง และความแปรปรวนของการถอดรหัสย้อนกลับ ล้วนส่งผลต่อการประมาณค่า แนวทาง MIQE จึงระบุรายละเอียดการทดลองและการตรวจสอบที่จำเป็นเพื่อให้ผลลัพธ์สามารถตีความได้ (Bustin et al., 2009) Digital PCR จะแบ่งตัวอย่างออกเป็นปฏิกิริยาจำนวนมากและนับส่วนที่ให้ผลบวก ซึ่งให้การหาปริมาณสัมบูรณ์โดยไม่ต้องใช้กราฟมาตรฐาน (Huggett et al., 2013)

Clinical relevance

RT-qPCR เป็นแพลตฟอร์มปกติสำหรับการวัดระดับการถอดรหัสที่อยู่เบื้องหลังผลการวินิจฉัยและการพยากรณ์โรคทางโมเลกุล และการทำความเข้าใจข้อสมมติฐานของมันเป็นส่วนหนึ่งของการตีความรายงานทางห้องปฏิบัติการ ข้อมูลนี้อธิบายวิธีการและข้อจำกัดของมัน และไม่ใช่พื้นฐานสำหรับการตัดค่าการวินิจฉัยหรือการจัดการผู้ป่วย ซึ่งขึ้นอยู่กับการทดสอบที่ผ่านการตรวจสอบแล้ว

Evidence & guidelines

ข้อกำหนดด้านการรายงานและคุณภาพสำหรับ real-time PCR ระบุไว้ในแนวทาง MIQE (Bustin et al., 2009) และสำหรับ digital PCR คือแนวทาง digital MIQE (Huggett et al., 2013) วิธี 2-DDCT แบบเปรียบเทียบ (Livak & Schmittgen, 2001) ยังคงเป็นข้อมูลอ้างอิงมาตรฐานสำหรับการหาปริมาณสัมพัทธ์

History

Real-time PCR เกิดขึ้นในทศวรรษ 1990 เมื่อการตรวจจับด้วยฟลูออเรสเซนต์ถูกนำมาใช้ร่วมกับการวนรอบอุณหภูมิ แทนที่การหาปริมาณแบบ endpoint ที่ต้องใช้แรงงานมาก วิธี 2-DDCT แบบเปรียบเทียบ (2001) ได้กำหนดมาตรฐานการหาปริมาณสัมพัทธ์ แนวทาง MIQE (2009) ได้แก้ไขปัญหาความสามารถในการทำซ้ำที่แพร่หลาย และ digital PCR ได้ขยายขอบเขตไปสู่การหาปริมาณสัมบูรณ์ในภายหลัง

Debates

ควรเลือกยีนอ้างอิงสำหรับการปรับให้เป็นมาตรฐานอย่างไร?

การหาปริมาณสัมพัทธ์สมมติว่าการแสดงออกของยีนอ้างอิงมีความเสถียรในทุกสภาวะ แต่ยีน housekeeping เดี่ยวอาจแตกต่างกันไป การใช้ยีนอ้างอิงหลายตัวที่ผ่านการตรวจสอบแล้วเป็นสิ่งแนะนำเพื่อหลีกเลี่ยงการปรับให้เป็นมาตรฐานที่มีอคติ

Key figures

• Stephen Bustin
• Kenneth Livak
• Thomas Schmittgen
• Jim Huggett

Seminal works

• livak-2001
• bustin-2009
• huggett-2013

Frequently asked questions

ค่า Ct ที่ต่ำกว่าหมายความว่าอย่างไร?

รอบการหาปริมาณ (Ct หรือ Cq) ที่ต่ำกว่าหมายความว่าการเรืองแสงข้ามเกณฑ์เร็วกว่า ซึ่งบ่งชี้ว่ามีแม่แบบเป้าหมายเริ่มต้นมากขึ้น; Ct มีความสัมพันธ์ผกผันกับลอการิทึมของปริมาณเริ่มต้น

Digital PCR แตกต่างจาก real-time qPCR อย่างไร?

Digital PCR แบ่งปฏิกิริยาออกเป็นช่องเล็กๆ จำนวนมากและนับจำนวนช่องที่มีเป้าหมาย ซึ่งให้การนับสัมบูรณ์โดยไม่ต้องใช้กราฟมาตรฐาน ในขณะที่ real-time qPCR อนุมานปริมาณจากรอบการหาปริมาณ ซึ่งโดยปกติแล้วจะเป็นการวัดสัมพัทธ์