การประกันคุณภาพในการตรวจวิเคราะห์โมเลกุลเชิงปริมาณ

การประกันคุณภาพในการตรวจวิเคราะห์โมเลกุลเชิงปริมาณคือระบบของมาตรฐาน การควบคุม และแนวปฏิบัติในการรายงานผล ซึ่งทำให้การวัดการแสดงออกของยีนมีความแม่นยำ สามารถทำซ้ำได้ และเปรียบเทียบกันได้ในแต่ละครั้งของการทดลองและระหว่างห้องปฏิบัติการ หากไม่มีระบบนี้ ผลลัพธ์เชิงตัวเลขที่ได้จาก qPCR, RNA-seq หรือการตรวจวิเคราะห์หลายยีนก็ไม่สามารถเชื่อถือหรือนำไปเปรียบเทียบได้

Definition

การประกันคุณภาพในการตรวจวิเคราะห์โมเลกุลเชิงปริมาณคือการใช้ขั้นตอนที่เป็นมาตรฐาน การควบคุม วัสดุอ้างอิง และการรายงานผลที่โปร่งใสอย่างประสานงานกัน เพื่อให้แน่ใจว่าการวัดการแสดงออกของยีนหรือโปรตีนนั้นมีความถูกต้องเชิงวิเคราะห์และสามารถทำซ้ำได้

Scope

หัวข้อนี้ครอบคลุมแหล่งที่มาของความแปรปรวนในการตรวจวิเคราะห์เชิงปริมาณในระยะก่อนการวิเคราะห์ ระยะการวิเคราะห์ และระยะหลังการวิเคราะห์ บทบาทของวัสดุอ้างอิงและการควบคุมแบบ spike-in หน้าที่ของมาตรฐานการรายงานผล เช่น MIQE และการศึกษาเปรียบเทียบมาตรฐานของกลุ่มความร่วมมือที่สร้างความสามารถในการทำซ้ำของแพลตฟอร์ม หัวข้อนี้จัดทำขึ้นในฐานะหัวข้อระเบียบวิธีวิจัยและมาตรฐาน ไม่ใช่คู่มือขั้นตอนการปฏิบัติงานของห้องปฏิบัติการหรือคู่มือการรับรอง

Core questions

• แหล่งที่มาของข้อผิดพลาดในระยะก่อนการวิเคราะห์ ระยะการวิเคราะห์ และระยะหลังการวิเคราะห์คืออะไร?
• วัสดุอ้างอิงและการควบคุมช่วยยึดโยงการวัดเชิงปริมาณได้อย่างไร?
• เหตุใดการรายงานผลที่โปร่งใสจึงมีความสำคัญต่อความสามารถในการทำซ้ำ?
• ความสามารถในการทำซ้ำของแพลตฟอร์มการวัดแสดงให้เห็นได้อย่างไร?

Key concepts

• ระยะก่อนการวิเคราะห์ ระยะการวิเคราะห์ และระยะหลังการวิเคราะห์
• วัสดุอ้างอิงและสารสอบเทียบ
• การควบคุมแบบ Spike-in และการควบคุมกระบวนการ
• มาตรฐานการรายงานผล (เช่น MIQE)
• ความสามารถในการทำซ้ำระหว่างห้องปฏิบัติการ
• ความถูกต้องเชิงวิเคราะห์

Mechanisms

ความแปรปรวนสามารถเกิดขึ้นได้ในทุกขั้นตอนของการตรวจวิเคราะห์เชิงปริมาณ: การเก็บตัวอย่างและความสมบูรณ์ของ RNA (ระยะก่อนการวิเคราะห์), ประสิทธิภาพการเพิ่มจำนวน, ความลึกของการจัดลำดับ, ประสิทธิภาพของแอนติบอดี และความคลาดเคลื่อนระหว่างการทดลอง (ระยะการวิเคราะห์), และการทำให้เป็นมาตรฐาน, การกำหนดค่าเกณฑ์, และการตีความ (ระยะหลังการวิเคราะห์) การประกันคุณภาพจะช่วยแก้ไขปัญหาเหล่านี้โดยการกำหนดขั้นตอนการปฏิบัติงานที่แน่นอน รวมถึงการควบคุมเชิงบวก เชิงลบ และการควบคุมกระบวนการ และการอ้างอิงการวัดกับวัสดุอ้างอิงและมาตรฐานแบบ spike-in เพื่อให้สามารถสอบเทียบสัญญาณได้ การรายงานองค์ประกอบเหล่านี้อย่างโปร่งใส ตามที่กำหนดโดยแนวทาง MIQE และ digital MIQE (Bustin et al., 2009; Huggett et al., 2013) ช่วยให้ผู้อื่นสามารถประเมินและทำซ้ำผลลัพธ์ได้ การศึกษาขนาดใหญ่จากหลายห้องปฏิบัติการแสดงให้เห็นถึงความสามารถในการทำซ้ำที่ทำได้จริงของแพลตฟอร์มไมโครอาร์เรย์และ RNA-seq และกำหนดแนวปฏิบัติที่สนับสนุนสิ่งนี้ (MAQC Consortium, 2006; SEQC/MAQC-III Consortium, 2014)

Clinical relevance

การประกันคุณภาพที่เชื่อถือได้เป็นสิ่งสำคัญที่ทำให้การวัดระดับโมเลกุลสามารถนำไปใช้ในการรายงานผลการวินิจฉัยและการพยากรณ์โรคได้ และการทำความเข้าใจองค์ประกอบของการประกันคุณภาพจะช่วยในการประเมินความน่าเชื่อถือของผลลัพธ์ บทความนี้อธิบายหลักการและมาตรฐานคุณภาพในระดับระเบียบวิธีวิจัย และไม่ได้ถือเป็นระเบียบปฏิบัติของห้องปฏิบัติการทางคลินิก ข้อกำหนดการรับรอง หรือพื้นฐานสำหรับการจัดการผู้ป่วย

Evidence & guidelines

มาตรฐานการรายงานผลสำหรับ quantitative PCR และ digital PCR ถูกกำหนดโดยแนวทาง MIQE และ digital MIQE (Bustin et al., 2009; Huggett et al., 2013) ความสามารถในการทำซ้ำของแพลตฟอร์มการแสดงออกของยีนได้รับการบันทึกโดยโครงการ MicroArray Quality Control (MAQC Consortium, 2006) และการศึกษา Sequencing Quality Control สำหรับ RNA-seq (SEQC/MAQC-III Consortium, 2014)

History

เมื่อการตรวจวิเคราะห์โมเลกุลเชิงปริมาณแพร่หลายในช่วงทศวรรษ 2000 ความกังวลเกี่ยวกับผลลัพธ์ที่ไม่สามารถทำซ้ำได้กระตุ้นให้เกิดการกำหนดมาตรฐานอย่างประสานงานกัน โครงการ MAQC (2006) ได้ทดสอบความสามารถในการทำซ้ำของไมโครอาร์เรย์ในห้องปฏิบัติการต่างๆ แนวทาง MIQE (2009) ได้กำหนดมาตรฐานการรายงานผล qPCR และความพยายามในภายหลังได้ขยายไปสู่ digital PCR (2013) และ RNA-seq (2014) ซึ่งเป็นการสร้างการประกันคุณภาพให้เป็นสาขาวิชาหนึ่งในการวิเคราะห์การแสดงออกเชิงปริมาณ

Debates

การวัดผลระหว่างแพลตฟอร์มและห้องปฏิบัติการต่างๆ สามารถเปรียบเทียบกันได้มากน้อยเพียงใด?

แม้จะมีการควบคุม ค่าสัมบูรณ์อาจแตกต่างกันระหว่างแพลตฟอร์มและสถานที่ ดังนั้นจึงเน้นที่การเปรียบเทียบเชิงสัมพัทธ์ วัสดุอ้างอิงร่วมกัน และการรายงานผลที่โปร่งใส; การที่ผลลัพธ์ข้ามแพลตฟอร์มจะสามารถประสานกันได้มากน้อยเพียงใดยังคงเป็นคำถามเชิงระเบียบวิธีวิจัยที่เปิดกว้าง

Key figures

• Stephen Bustin
• Jim Huggett
• Leming Shi

Seminal works

• bustin-2009
• maqc-2006
• seqc-2014

Frequently asked questions

วัสดุอ้างอิงและการควบคุมในการตรวจวิเคราะห์โมเลกุลแตกต่างกันอย่างไร?

วัสดุอ้างอิงคือมาตรฐานที่ได้รับการระบุคุณลักษณะซึ่งใช้ในการสอบเทียบหรือยึดโยงการวัด ในขณะที่การควบคุมคือตัวอย่างที่ใช้ร่วมกับตัวอย่างทดสอบเพื่อยืนยันว่าการตรวจวิเคราะห์ทำงานได้ตามที่คาดไว้ ทั้งสองมีส่วนช่วยในการประกันคุณภาพแต่มีบทบาทที่แตกต่างกัน

เหตุใดมาตรฐานการรายงานผลเช่น MIQE จึงมีความสำคัญ?

มาตรฐานระบุรายละเอียดการทดลองที่ต้องเปิดเผย เพื่อให้ผลลัพธ์เชิงปริมาณสามารถประเมินและทำซ้ำได้โดยผู้อื่น หากไม่มีมาตรฐานเหล่านี้ ความแตกต่างระหว่างการศึกษาอาจสะท้อนถึงความแปรปรวนทางเทคนิคที่ไม่ได้บันทึกไว้ มากกว่าที่จะเป็นความแตกต่างทางชีววิทยา