วิธีการและเทคนิคการวินิจฉัยระดับโมเลกุล

วิธีการวินิจฉัยระดับโมเลกุลตรวจจับและจำแนกลักษณะของโรคในระดับกรดนิวคลีอิกและโมเลกุลอื่นๆ มากกว่าการอาศัยเพียงแค่สัณฐานวิทยาของเซลล์หรือเนื้อเยื่อเท่านั้น บทความนี้จะแนะนำผู้อ่านให้รู้จักกับเทคโนโลยีหลักๆ ในห้องปฏิบัติการพยาธิวิทยาโมเลกุล ได้แก่ การเพิ่มปริมาณ (amplification), การหาลำดับ (sequencing), การผสมพันธุ์ (hybridization), การวิเคราะห์เชิงปริมาณ (quantitative analysis) และการเก็บตัวอย่างชีวภาพหมุนเวียน (circulating biomarkers) รวมถึงวิธีการที่แต่ละเทคนิคเปลี่ยนตัวอย่างทางชีวภาพให้เป็นข้อมูลระดับโมเลกุลที่อ่านได้

Definition

เทคนิคการวินิจฉัยระดับโมเลกุลคือวิธีการทางห้องปฏิบัติการที่ใช้ในการระบุ, เพิ่มปริมาณ, หาลำดับ, วัดปริมาณ, หรือระบุตำแหน่งของลำดับกรดนิวคลีอิกจำเพาะ (และโมเลกุลที่เกี่ยวข้อง) เพื่อจำแนกลักษณะพื้นฐานระดับโมเลกุลของโรค

Scope

บทความนี้ให้ภาพรวมระดับสูงของเทคนิคที่ใช้ในพยาธิวิทยาโมเลกุลและจัดกลุ่มออกเป็นห้าหัวข้อ ได้แก่ การเพิ่มปริมาณกรดนิวคลีอิก, การหาลำดับดีเอ็นเอและอาร์เอ็นเอ, วิธีการทางเซลล์พันธุกรรมและ FISH, การวิเคราะห์เชิงปริมาณแบบเรียลไทม์และการวิเคราะห์จำนวนสำเนา, และการตรวจชิ้นเนื้อเหลว (liquid biopsy) โดยนำเสนอในฐานะเอกสารอ้างอิงทางระเบียบวิธีวิจัย ไม่ใช่ระเบียบปฏิบัติหรือแนวทางปฏิบัติทางคลินิก

Sub-topics

• Cytogenetic and FISH Techniques
• DNA and RNA Sequencing Methods
• Liquid Biopsy and Circulating Biomarkers
• PCR and Nucleic Acid Amplification Techniques
• Real-Time Quantitative Analysis and Copy Number Assessment

Key concepts

• การเพิ่มปริมาณกรดนิวคลีอิก
• การหาลำดับดีเอ็นเอและอาร์เอ็นเอ
• การผสมพันธุ์และการตรวจจับในแหล่งกำเนิด
• การหาปริมาณและการวิเคราะห์จำนวนสำเนา
• ชีวภาพหมุนเวียนและการตรวจชิ้นเนื้อเหลว
• ความไวและความจำเพาะในการวิเคราะห์

Mechanisms

วิธีการต่างๆ ในบทความนี้มีหลักการร่วมกันคือ: กรดนิวคลีอิกเป้าหมายจะถูกจับหรือสกัดออกมา จากนั้นจะถูกเพิ่มปริมาณแบบจำเพาะ, ผสมพันธุ์, หาลำดับ, หรือวัดปริมาณ เพื่อสร้างสัญญาณที่สามารถวัดได้ เทคนิคการเพิ่มปริมาณ เช่น ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส (polymerase chain reaction) ทำให้ลำดับที่หายากสามารถตรวจจับได้ (Saiki et al., 1985); การหาลำดับจะอ่านลำดับของเบสโดยการสิ้นสุดสาย (chain termination) (Sanger et al., 1977) หรือโดยแพลตฟอร์มแบบขนานขนาดใหญ่ (massively parallel platforms) (Goodwin et al., 2016); วิธีการที่อาศัยการผสมพันธุ์จะระบุตำแหน่งของลำดับภายในเซลล์หรือโครโมโซม; และวิธีการเชิงปริมาณจะประมาณปริมาณของเป้าหมายที่มีอยู่ การตรวจชิ้นเนื้อเหลวขยายขอบเขตการใช้เครื่องมือเหล่านี้ไปยังกรดนิวคลีอิกที่หลุดออกมาในเลือดและของเหลวอื่นๆ (Wan et al., 2017)

Clinical relevance

เทคนิคการวินิจฉัยระดับโมเลกุลเป็นรากฐานสำคัญของพยาธิวิทยาการวินิจฉัยร่วมสมัย ตั้งแต่การตรวจจับเชื้อโรคไปจนถึงการจำแนกลักษณะของเนื้องอก บทความนี้อธิบายเทคโนโลยีต่างๆ ในฐานะกรอบอ้างอิงสำหรับการทำความเข้าใจว่าผลลัพธ์ระดับโมเลกุลเกิดขึ้นได้อย่างไร; ไม่ใช่แนวทางในการสั่ง, ตีความ, หรือดำเนินการใดๆ กับการทดสอบเฉพาะเจาะจงในการดูแลผู้ป่วย

Evidence & guidelines

วิธีการในบทความนี้ได้รับการสนับสนุนจากวรรณกรรมปฐมภูมิและวรรณกรรมทบทวนจำนวนมาก ครอบคลุมตั้งแต่คำอธิบายพื้นฐานของ PCR และ Sanger sequencing ไปจนถึงการหาลำดับยุคใหม่ (next-generation sequencing) และการทบทวนดีเอ็นเอเนื้องอกหมุนเวียน (circulating-tumor-DNA) (Saiki et al., 1985; Sanger et al., 1977; Goodwin et al., 2016; Wan et al., 2017) มาตรฐานการรายงานโดยละเอียดและข้อเสนอแนะที่เป็นเอกฉันท์จะกล่าวถึงในแต่ละหัวข้อ

History

การวินิจฉัยระดับโมเลกุลเติบโตมาจากการบรรจบกันของเทคโนโลยีดีเอ็นเอลูกผสม (recombinant DNA technology) ในทศวรรษ 1970, การหาลำดับแบบสิ้นสุดสายของแซงเกอร์ (Sanger's chain-termination sequencing) (1977), และการคิดค้น PCR ในช่วงกลางทศวรรษ 1980 (Saiki et al., 1985) ทศวรรษต่อมาได้เพิ่มเทคนิค PCR เชิงปริมาณแบบเรียลไทม์ (real-time quantitative PCR), การผสมพันธุ์แบบฟลูออเรสเซนต์ในแหล่งกำเนิด (fluorescence in situ hybridization), ไมโครอาร์เรย์ (microarrays), และการหาลำดับปริมาณมาก (high-throughput sequencing) ซึ่งขยายขอบเขตของสาขาจากการทดสอบยีนเดี่ยวไปสู่การวิเคราะห์ระดับจีโนม (Goodwin et al., 2016) และล่าสุดคือการตรวจชิ้นเนื้อเหลวแบบรุกล้ำน้อยที่สุด (minimally invasive liquid biopsy) (Wan et al., 2017)

Key figures

• Kary Mullis
• Frederick Sanger
• Russell Higuchi

Seminal works

• saiki-1985
• sanger-1977
• goodwin-2016

Frequently asked questions

อะไรคือความแตกต่างระหว่างการวินิจฉัยระดับโมเลกุลกับพยาธิวิทยาแบบดั้งเดิม?

พยาธิวิทยาแบบดั้งเดิมอาศัยลักษณะที่ปรากฏของเซลล์และเนื้อเยื่อเป็นหลัก ในขณะที่การวินิจฉัยระดับโมเลกุลจะตรวจจับและจำแนกลักษณะของลำดับกรดนิวคลีอิกจำเพาะและการเปลี่ยนแปลงระดับโมเลกุลโดยตรง ซึ่งมักจะเผยให้เห็นการเปลี่ยนแปลงที่มองไม่เห็นภายใต้กล้องจุลทรรศน์

เทคนิคการวินิจฉัยระดับโมเลกุลหลักๆ มีอะไรบ้าง?

ได้แก่ การเพิ่มปริมาณกรดนิวคลีอิก, การหาลำดับดีเอ็นเอและอาร์เอ็นเอ, วิธีการทางเซลล์พันธุกรรมและการผสมพันธุ์ในแหล่งกำเนิด, การวิเคราะห์เชิงปริมาณแบบเรียลไทม์และการวิเคราะห์จำนวนสำเนา, และการวิเคราะห์ชีวภาพหมุนเวียนผ่านการตรวจชิ้นเนื้อเหลว