เทคนิค PCR และการเพิ่มปริมาณกรดนิวคลีอิก

เทคนิคการเพิ่มปริมาณกรดนิวคลีอิกจะคัดลอกลำดับ DNA หรือ RNA ที่เลือกไว้หลายครั้ง เพื่อให้เป้าหมายที่มีอยู่ในปริมาณน้อยมากสามารถตรวจจับและวัดผลได้ ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส (PCR) เป็นต้นแบบ: โดยผ่านวงจรซ้ำของการคลายเกลียว (denaturation), การจับคู่ของไพรเมอร์ (primer annealing) และการขยายโดยโพลีเมอเรส (polymerase extension) ทำให้เกิดการเพิ่มขึ้นแบบทวีคูณของลำดับที่กำหนด ซึ่งเป็นรากฐานสำคัญของการวินิจฉัยระดับโมเลกุล

Definition

เทคนิคการเพิ่มปริมาณกรดนิวคลีอิกเป็นวิธีการในหลอดทดลองที่สร้างสำเนาของลำดับ DNA หรือ RNA ที่จำเพาะจำนวนมากด้วยเอนไซม์ โดย PCR ใช้การวนรอบอุณหภูมิ (thermal cycling) และ DNA โพลีเมอเรส เพื่อเพิ่มปริมาณบริเวณที่กำหนดโดยไพรเมอร์สองตัว

Scope

หัวข้อนี้ครอบคลุม PCR แบบดั้งเดิม (end-point PCR), PCR แบบเรียลไทม์ (เชิงปริมาณ), PCR แบบย้อนกลับ (reverse-transcription PCR) สำหรับเป้าหมาย RNA และทางเลือกแบบไอโซเทอร์มอล เช่น การเพิ่มปริมาณแบบไอโซเทอร์มอลที่อาศัยลูป (loop-mediated isothermal amplification) โดยกล่าวถึงหลักการ ส่วนประกอบ และข้อควรพิจารณาในการรายงานผลของการเพิ่มปริมาณในฐานะข้อมูลอ้างอิงทางระเบียบวิธีวิจัย ไม่ใช่ในฐานะระเบียบวิธีทดสอบหรือแนวทางปฏิบัติทางคลินิก

Key concepts

• การวนรอบอุณหภูมิ (การคลายเกลียว, การจับคู่, การขยาย)
• ไพรเมอร์และ DNA โพลีเมอเรส
• การเพิ่มปริมาณแบบทวีคูณ
• PCR แบบย้อนกลับสำหรับเป้าหมาย RNA
• PCR แบบเรียลไทม์ (เชิงปริมาณ)
• การเพิ่มปริมาณแบบไอโซเทอร์มอล (เช่น LAMP)
• การควบคุมการปนเปื้อนและผลบวกลวง

Mechanisms

ใน PCR, DNA สายคู่จะถูกคลายเกลียวด้วยความร้อนให้เป็นสายเดี่ยว, ไพรเมอร์โอลิโกนิวคลีโอไทด์สั้นๆ จะจับคู่กับลำดับที่ขนาบข้างเป้าหมาย, และ DNA โพลีเมอเรสที่ทนความร้อนจะขยายไพรเมอร์เพื่อสังเคราะห์สายใหม่ที่เข้าคู่กัน; การทำซ้ำวงจรจะเพิ่มปริมาณเป้าหมายเป็นสองเท่าในแต่ละรอบ ทำให้เกิดการเพิ่มปริมาณแบบทวีคูณ (Saiki et al., 1985; Mullis et al., 1986) เป้าหมาย RNA จะถูกเปลี่ยนเป็น DNA สายคู่เสริม (complementary DNA) โดยเอนไซม์รีเวิร์สทรานสคริปเตสก่อนการเพิ่มปริมาณ PCR แบบเรียลไทม์จะติดตามการสะสมของผลิตภัณฑ์ทีละรอบโดยใช้สารเรืองแสง ทำให้สามารถหาปริมาณได้ (Heid et al., 1996) วิธีการแบบไอโซเทอร์มอล เช่น การเพิ่มปริมาณแบบไอโซเทอร์มอลที่อาศัยลูป จะเพิ่มปริมาณที่อุณหภูมิเดียว โดยไม่ต้องใช้วงจรความร้อน (Notomi et al., 2000)

Clinical relevance

เทคนิคการเพิ่มปริมาณถูกนำมาใช้อย่างแพร่หลายในการตรวจหาเชื้อโรคและระบุลักษณะเป้าหมายทางพันธุกรรมในห้องปฏิบัติการวินิจฉัย บทความนี้อธิบายว่าการเพิ่มปริมาณทำงานอย่างไรและรายงานประสิทธิภาพอย่างไร; เป็นข้อมูลอ้างอิงทางระเบียบวิธีวิจัยและไม่ได้ให้คำแนะนำสำหรับการสั่งหรือการตีความการทดสอบใดๆ ในการดูแลผู้ป่วย

Evidence & guidelines

แนวทาง MIQE (Bustin et al., 2009) กำหนดข้อมูลขั้นต่ำที่จำเป็นสำหรับการรายงานผลการทดลอง PCR แบบเรียลไทม์เชิงปริมาณ และเป็นข้อมูลอ้างอิงที่อ้างถึงอย่างกว้างขวางเพื่อความโปร่งใสและความสามารถในการทำซ้ำได้ การศึกษาหลักพื้นฐานอธิบายวิธีการ PCR ดั้งเดิมและการหาปริมาณแบบเรียลไทม์ (Saiki et al., 1985; Heid et al., 1996) ในขณะที่งานวิจัยต่อมาได้นำเสนอทางเลือกแบบไอโซเทอร์มอล (Notomi et al., 2000)

History

PCR ถูกคิดค้นโดย Kary Mullis และนำมาประยุกต์ใช้กับปัญหาการวินิจฉัยครั้งแรก — การตรวจหาการกลายพันธุ์ของเซลล์เม็ดเลือดแดงรูปเคียว — โดย Saiki และคณะในปี 1985 โดยวิธีการนี้ได้รับการอธิบายอย่างเป็นทางการในปี 1986 (Saiki et al., 1985; Mullis et al., 1986) การนำโพลีเมอเรสที่ทนความร้อนมาใช้ทำให้กระบวนการเป็นไปโดยอัตโนมัติ และการตรวจจับแบบเรียลไทม์ในช่วงทศวรรษ 1990 ได้เพิ่มความสามารถในการหาปริมาณ (Heid et al., 1996) เทคนิคแบบไอโซเทอร์มอลในภายหลังได้ขยายการเพิ่มปริมาณไปยังการตั้งค่าที่ไม่มีเครื่องควบคุมอุณหภูมิ (Notomi et al., 2000)

Key figures

• Kary Mullis
• Randall Saiki
• Henry Erlich

Seminal works

• saiki-1985
• heid-1996
• bustin-2009

Frequently asked questions

เหตุใด PCR จึงเพิ่มปริมาณเป้าหมายแบบทวีคูณ?

แต่ละรอบจะคัดลอก DNA สายเป้าหมายที่มีอยู่ทั้งหมด ดังนั้นจำนวนสำเนาจะเพิ่มขึ้นเป็นสองเท่าในแต่ละรอบ; หลังจากหลายรอบ ลำดับที่เริ่มต้นด้วยโมเลกุลเพียงไม่กี่โมเลกุลสามารถเพิ่มขึ้นเป็นพันล้านสำเนาได้

การเพิ่มปริมาณแบบไอโซเทอร์มอลแตกต่างจาก PCR อย่างไร?

วิธีการแบบไอโซเทอร์มอล เช่น การเพิ่มปริมาณแบบไอโซเทอร์มอลที่อาศัยลูป จะเพิ่มปริมาณ DNA ที่อุณหภูมิคงที่เพียงอุณหภูมิเดียวโดยใช้ไพรเมอร์และเอนไซม์พิเศษ ซึ่งช่วยลดความจำเป็นในการทำซ้ำวงจรการให้ความร้อนและความเย็นที่ PCR แบบดั้งเดิมต้องการ