การวิเคราะห์การแสดงออกของยีนเชิงปริมาณ

การวิเคราะห์การแสดงออกของยีนเชิงปริมาณคือชุดของวิธีการทางโมเลกุลที่ใช้ในการวัดปริมาณการแสดงออกของยีนในเนื้อเยื่อหรือประชากรเซลล์ โดยการหาปริมาณสารพันธุกรรมอาร์เอ็นเอ (messenger RNA transcripts) หรือผลิตภัณฑ์โปรตีนของยีนนั้นๆ ในพยาธิวิทยาโมเลกุล การวิเคราะห์นี้ให้หลักฐานเชิงตัวเลขที่เชื่อมโยงกิจกรรมทางโมเลกุลของตัวอย่างกับการวินิจฉัย การจำแนกประเภท และการพยากรณ์โรค

Definition

การวิเคราะห์การแสดงออกของยีนเชิงปริมาณคือการวัดปริมาณผลิตภัณฑ์ของยีน (สารพันธุกรรมอาร์เอ็นเอ หรือโปรตีน) ในตัวอย่างทางชีวภาพ ซึ่งแสดงในมาตราส่วนสัมพัทธ์หรือสัมบูรณ์ เพื่อบ่งชี้สถานะทางโมเลกุลของเซลล์หรือเนื้อเยื่อ

Scope

เนื้อหาส่วนนี้จะแนะนำผู้อ่านเกี่ยวกับแพลตฟอร์มเชิงปริมาณหลักที่ใช้ในพยาธิวิทยาและเวชศาสตร์ห้องปฏิบัติการ ได้แก่ ปฏิกิริยาโพลีเมอเรสลูกโซ่แบบเรียลไทม์และเชิงปริมาณ (real-time and quantitative PCR), การหาลำดับอาร์เอ็นเอ (RNA sequencing) และทรานสคริปโตมิกส์ (transcriptomics), อิมมูโนฮิสโตเคมี (immunohistochemistry) และวิธีการตรวจจับโปรตีนอื่นๆ, ลายเซ็นการแสดงออกของยีนเพื่อการพยากรณ์โรคที่ได้จากการวัดเหล่านี้, และแนวปฏิบัติการประกันคุณภาพที่ทำให้ตัวเลขมีความน่าเชื่อถือ เนื้อหานี้จะนำเสนอสิ่งเหล่านี้ในฐานะระเบียบวิธีวัดผล ไม่ใช่คำแนะนำทางคลินิก

Sub-topics

• Gene Expression Signatures and Prognostic Markers
• Immunohistochemistry and Protein Detection Methods
• Quality Assurance in Quantitative Molecular Assays
• Real-Time PCR and Quantitative PCR Applications
• RNA Sequencing and Transcriptomics

Core questions

• ปริมาณของสารพันธุกรรมอาร์เอ็นเอหรือโปรตีนถูกวัดและทำให้เป็นมาตรฐานได้อย่างไร?
• เมื่อใดที่การวัดสัมพัทธ์เพียงพอ และเมื่อใดที่จำเป็นต้องมีการหาปริมาณสัมบูรณ์?
• การวัดการแสดงออกถูกแปลเป็นการจำแนกประเภทเพื่อการวินิจฉัยหรือการพยากรณ์โรคได้อย่างไร?
• การควบคุมและมาตรฐานใดที่ทำให้ผลลัพธ์เชิงปริมาณสามารถทำซ้ำได้ในห้องปฏิบัติการต่างๆ?

Key concepts

• ปริมาณสารพันธุกรรมอาร์เอ็นเอและปริมาณโปรตีน
• การหาปริมาณสัมพัทธ์เทียบกับการหาปริมาณสัมบูรณ์
• การทำให้เป็นมาตรฐานและยีนอ้างอิง
• ลายเซ็นการแสดงออกของยีน
• ความถูกต้องของการวิเคราะห์และความสามารถในการทำซ้ำ
• ระยะก่อนการวิเคราะห์ ระยะการวิเคราะห์ และระยะหลังการวิเคราะห์

Mechanisms

วิธีการแสดงออกเชิงปริมาณทั้งหมดจะเปลี่ยนปริมาณโมเลกุลให้เป็นสัญญาณที่วัดได้ซึ่งแปรผันตามปริมาณของเป้าหมาย ปฏิกิริยาโพลีเมอเรสลูกโซ่เชิงปริมาณแบบย้อนกลับ (reverse-transcription quantitative PCR) จะขยายดีเอ็นเอสายคู่ (cDNA) และอ่านรอบที่สัญญาณเรืองแสงถึงเกณฑ์ โดยทั่วไปการหาปริมาณสัมพัทธ์จะรายงานโดยใช้วิธี 2-DDCT แบบเปรียบเทียบ (Livak & Schmittgen, 2001) การหาลำดับอาร์เอ็นเอจะนับจำนวนอ่านที่จับคู่กับสารพันธุกรรมอาร์เอ็นเอ โดยเปลี่ยนความลึกของการหาลำดับเป็นการประมาณค่าการแสดงออก (Wang et al., 2009) อิมมูโนฮิสโตเคมีจะตรวจจับโปรตีนด้วยแอนติบอดีที่มีฉลากและรายงานความเข้มและขอบเขตของการย้อมสี ในทุกแพลตฟอร์ม สัญญาณดิบจะต้องถูกทำให้เป็นมาตรฐานอ้างอิง เพื่อให้ความแตกต่างทางชีวภาพสามารถแยกออกจากความแปรปรวนทางเทคนิคได้ ซึ่งเป็นข้อกำหนดที่กำหนดเป็นทางการสำหรับ qPCR โดยแนวทาง MIQE (Bustin et al., 2009)

Clinical relevance

การวัดการแสดงออกเชิงปริมาณเป็นพื้นฐานของการจำแนกประเภทเนื้องอกทางโมเลกุล การรายงานตัวบ่งชี้ทางชีวภาพ และการทดสอบการพยากรณ์โรคแบบหลายยีน และการอ่านค่าเหล่านี้อย่างมีวิจารณญาณเป็นส่วนหนึ่งของการปฏิบัติงานในเวชศาสตร์ห้องปฏิบัติการ บทความนี้อธิบายว่าการวัดดังกล่าวถูกสร้างและตีความอย่างไรในฐานะสาขาของระเบียบวิธีวิจัย ไม่ใช่แหล่งของเกณฑ์การวินิจฉัยหรือการตัดสินใจในการรักษา ซึ่งเป็นส่วนหนึ่งของการทดสอบที่ได้รับการตรวจสอบความถูกต้องและแนวทางปฏิบัติทางคลินิก

Evidence & guidelines

วรรณกรรมระเบียบวิธีวิจัยครอบคลุมมาตรฐานการรายงาน เช่น แนวทาง MIQE สำหรับ qPCR (Bustin et al., 2009), คำอธิบายพื้นฐานของ RNA-seq ในฐานะแพลตฟอร์มเชิงปริมาณ (Wang et al., 2009; Mortazavi et al., 2008), และการสาธิตที่สำคัญว่าโปรไฟล์การแสดงออกสามารถให้ข้อมูลการพยากรณ์โรคได้ (van 't Veer et al., 2002) สิ่งเหล่านี้ร่วมกันกำหนดทั้งเทคนิคและมาตรฐานที่ใช้ในการตัดสินผลลัพธ์

History

การวิเคราะห์การแสดงออกเชิงปริมาณพัฒนาจากการทำ Northern blots ที่มีปริมาณงานต่ำและ RT-PCR ในยุคแรกๆ ไปสู่ real-time PCR ในทศวรรษ 1990, การทำโปรไฟล์โดยใช้ไมโครอะเรย์ประมาณปี 2000, และการหาลำดับอาร์เอ็นเอที่มีปริมาณงานสูงตั้งแต่ปลายทศวรรษ 2000 การศึกษาโปรไฟล์มะเร็งเต้านมในปี 2002 (van 't Veer et al.) แสดงให้เห็นว่ารูปแบบการแสดงออกสามารถทำนายผลลัพธ์ได้ และแนวทาง MIQE ในปี 2009 เป็นจุดเปลี่ยนไปสู่การหาปริมาณที่เป็นมาตรฐานและทำซ้ำได้

Key figures

• Stephen Bustin
• Kenneth Livak
• Laura van 't Veer

Seminal works

• bustin-2009
• wang-2009
• vantveer-2002
• livak-2001

Frequently asked questions

ความแตกต่างระหว่างการหาปริมาณสัมพัทธ์และการหาปริมาณสัมบูรณ์คืออะไร?

การหาปริมาณสัมพัทธ์จะเปรียบเทียบการแสดงออกของเป้าหมายกับค่าอ้างอิง (เช่น วิธี 2-DDCT แบบเปรียบเทียบใน qPCR) ในขณะที่การหาปริมาณสัมบูรณ์จะรายงานจำนวนสำเนาหรือความเข้มข้นที่แท้จริงเทียบกับมาตรฐานที่สอบเทียบแล้ว การศึกษาการแสดงออกส่วนใหญ่ใช้การวัดสัมพัทธ์; การวัดสัมบูรณ์ต้องมีการสอบเทียบเพิ่มเติม

เหตุใดการทำให้เป็นมาตรฐานจึงจำเป็นในการวิเคราะห์การแสดงออก?

สัญญาณดิบสะท้อนทั้งการแสดงออกทางชีวภาพและปัจจัยทางเทคนิค เช่น ปริมาณสารตั้งต้น ประสิทธิภาพ และความลึกของการหาลำดับ การทำให้เป็นมาตรฐานด้วยยีนอ้างอิงหรือมาตรฐานจะขจัดองค์ประกอบทางเทคนิคออกไป เพื่อให้ความแตกต่างที่วัดได้สะท้อนถึงชีววิทยาที่แท้จริง