การวินิจฉัยระดับโมเลกุล: PCR, RT-PCR และการเพิ่มจำนวนกรดนิวคลีอิก

การวินิจฉัยระดับโมเลกุลตรวจจับไวรัสโดยการเพิ่มจำนวนและระบุกรดนิวคลีอิกของไวรัส ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส (PCR) และสำหรับไวรัส RNA คือ reverse-transcription PCR (RT-PCR) จะคัดลอกลำดับจีโนมเป้าหมายหลายล้านครั้ง ทำให้แม้แต่จีโนมไวรัสในปริมาณที่น้อยมากก็สามารถตรวจจับได้ ซึ่งทำให้วิธีการเหล่านี้มีความไวและความจำเพาะสูง และเป็นหัวใจสำคัญของการวินิจฉัยไวรัสสมัยใหม่

Definition

การวินิจฉัยระดับโมเลกุลคือการตรวจจับ และหากจำเป็น การหาปริมาณกรดนิวคลีอิกของไวรัสด้วยเทคนิคการเพิ่มจำนวน เช่น PCR, RT-PCR และวิธีการแบบไอโซเทอร์มอล ซึ่งคัดลอกเป้าหมายจีโนมที่จำเพาะเจาะจงให้อยู่ในระดับที่ตรวจจับได้

Scope

หัวข้อนี้ครอบคลุมเทคนิคการเพิ่มจำนวนกรดนิวคลีอิกที่ใช้ในวิทยาระบบไวรัสวิทยา: PCR แบบดั้งเดิมและแบบเรียลไทม์, reverse-transcription PCR สำหรับไวรัส RNA, การวัดปริมาณไวรัส และทางเลือกแบบไอโซเทอร์มอล เช่น loop-mediated amplification โดยจะอธิบายหลักการและการตีความในระดับอ้างอิง และไม่ได้ให้โปรโตคอลการทดสอบหรือคำแนะนำการจัดการทางคลินิก

Core questions

• การเพิ่มจำนวนลำดับเป้าหมายทำให้สามารถตรวจจับไวรัสจากปริมาณเริ่มต้นที่น้อยมากได้อย่างไร?
• ไวรัส RNA ต้องการขั้นตอนเพิ่มเติมอะไรบ้างเมื่อเทียบกับไวรัส DNA?
• Real-time PCR ใช้ในการหาปริมาณไวรัสได้อย่างไร และ cycle threshold หมายถึงอะไร?
• เมื่อใดที่รูปแบบไอโซเทอร์มอลหรือมัลติเพล็กซ์ดีกว่า PCR แบบดั้งเดิม?

Key concepts

• ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส (PCR)
• การถอดรหัสย้อนกลับ (RT-PCR)
• ไพรเมอร์และความจำเพาะของเป้าหมาย
• การวนรอบอุณหภูมิและการเพิ่มจำนวนแบบทวีคูณ
• Real-time (quantitative) PCR
• Cycle threshold และปริมาณไวรัส
• การเพิ่มจำนวนแบบมัลติเพล็กซ์
• การเพิ่มจำนวนแบบไอโซเทอร์มอล (เช่น LAMP)

Mechanisms

PCR ใช้ไพรเมอร์สั้นๆ สองตัวที่ขนาบข้างบริเวณที่เลือกของจีโนมไวรัส, เอนไซม์ DNA polymerase ที่ทนความร้อน และวงจรการให้ความร้อนและความเย็นซ้ำๆ แต่ละรอบจะทำให้ DNA เสียสภาพ (denature), ไพรเมอร์จับคู่ (anneal) และสร้างสายใหม่ (extend) เพิ่มจำนวนเป้าหมายเป็นสองเท่า ทำให้เกิดการสะสมแบบทวีคูณ สำหรับไวรัส RNA ขั้นตอน reverse-transcription จะเปลี่ยนจีโนม RNA ให้เป็น complementary DNA ก่อนการเพิ่มจำนวน Real-time PCR ตรวจสอบการสะสมของผลิตภัณฑ์ทีละรอบโดยใช้สารเรืองแสง ทำให้สามารถหาปริมาณได้: ค่า cycle threshold ที่สัญญาณสูงกว่าพื้นหลังจะมีความสัมพันธ์ผกผันกับปริมาณแม่แบบเริ่มต้น ซึ่งให้ค่าประมาณของปริมาณไวรัส การออกแบบแบบ multiplex จะเพิ่มจำนวนเป้าหมายหลายตัวพร้อมกัน และวิธีการแบบไอโซเทอร์มอล เช่น loop-mediated amplification สามารถเพิ่มจำนวนได้ที่อุณหภูมิคงที่ ซึ่งช่วยลดความต้องการอุปกรณ์สำหรับการทดสอบแบบกระจายศูนย์

Clinical relevance

การเพิ่มจำนวนกรดนิวคลีอิกช่วยให้สามารถตรวจจับการติดเชื้อไวรัสที่กำลังดำเนินอยู่ได้อย่างไวและจำเพาะเจาะจง และสนับสนุนการติดตามปริมาณไวรัสที่ใช้ในการติดตามการติดเชื้อและการตอบสนองต่อการรักษา บทความนี้อธิบายว่าวิธีการทำงานอย่างไรและผลลัพธ์ เช่น cycle threshold ถูกตีความอย่างไรในหลักการ รวมถึงประเด็นที่ว่าการตรวจพบจีโนมเพียงอย่างเดียวไม่ได้พิสูจน์ว่ามีไวรัสที่ก่อให้เกิดการติดเชื้ออยู่; เป็นการอธิบายระเบียบวิธีวิจัยและไม่ใช่พื้นฐานสำหรับการตัดสินใจในการวินิจฉัยหรือการรักษาเฉพาะบุคคล

Epidemiology

Real-time RT-PCR กลายเป็นวิธีการอ้างอิงสำหรับการยืนยันการติดเชื้อ SARS-CoV-2 และการเผยแพร่ชุดทดสอบที่ได้รับการตรวจสอบความถูกต้องอย่างรวดเร็วในช่วงต้นปี 2020 ทำให้สามารถขยายขนาดการทดสอบระดับโมเลกุลทั่วโลกได้ ซึ่งแสดงให้เห็นว่าการเพิ่มจำนวนกรดนิวคลีอิกเป็นรากฐานของการตรวจจับและการเฝ้าระวังการระบาดได้อย่างไร

History

ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสถูกคิดค้นโดย Kary Mullis และนำไปใช้ในการวินิจฉัยทางพันธุกรรมครั้งแรกโดย Saiki และคณะในปี 1985 โดยวิธีการนี้ได้รับการจัดรูปแบบโดย Mullis และ Faloona ในปี 1987 Real-time quantitative PCR ซึ่งอธิบายโดย Heid และคณะในปี 1996 ได้เพิ่มการหาปริมาณอย่างต่อเนื่อง และวิธีการแบบไอโซเทอร์มอล เช่น loop-mediated amplification ซึ่งนำเสนอโดย Notomi และคณะในปี 2000 ได้ขยายขอบเขตที่สามารถทำการเพิ่มจำนวนได้

Key figures

• Kary Mullis
• Randall Saiki
• Christian Drosten

Seminal works

• saiki-1985
• mullis-faloona-1987
• heid-1996
• corman-2020

Frequently asked questions

PCR และ RT-PCR แตกต่างกันอย่างไร?

PCR เพิ่มจำนวน DNA ดังนั้นจึงใช้โดยตรงสำหรับไวรัส DNA ส่วน RT-PCR เพิ่มขั้นตอนการถอดรหัสย้อนกลับที่เปลี่ยนจีโนม RNA ของไวรัสให้เป็น complementary DNA ก่อน ทำให้สามารถตรวจจับไวรัส RNA เช่น ไข้หวัดใหญ่และโคโรนาไวรัสได้

ผล PCR เป็นบวกหมายความว่ามีไวรัสที่ก่อให้เกิดการติดเชื้ออยู่หรือไม่?

ไม่จำเป็นเสมอไป PCR ตรวจจับจีโนมของไวรัส ซึ่งสามารถคงอยู่ได้หลังจากที่ไวรัสไม่สามารถจำลองตัวเองหรือก่อให้เกิดการติดเชื้อได้อีกต่อไป การยืนยันการมีอยู่ของไวรัสที่ก่อให้เกิดการติดเชื้อต้องอาศัยการเพาะเลี้ยงหรือการทดสอบการทำงานอื่นๆ ที่ตีความในบริบททางคลินิก