การวินิจฉัยระดับโมเลกุล: PCR และการหาลำดับเบส

วิธีการทางโมเลกุลตรวจจับและระบุเชื้อราจากกรดนิวคลีอิก แทนที่จะอาศัยการเพาะเลี้ยงหรือลักษณะภายนอก ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส (PCR) จะเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอของเชื้อราจากสิ่งส่งตรวจหรือเชื้อที่แยกได้ และการหาลำดับเบสของบริเวณที่อนุรักษ์ไว้ โดยเฉพาะอย่างยิ่งบริเวณ internal transcribed spacer ของกลุ่มยีนไรโบโซม จะอ่านดีเอ็นเอที่เพิ่มปริมาณขึ้นเพื่อระบุชื่อสิ่งมีชีวิต ซึ่งมักจะเร็วกว่าและแม่นยำกว่าการเพาะเลี้ยง

Definition

การวินิจฉัยเชื้อราด้วยวิธีโมเลกุลเป็นเทคนิคที่เพิ่มปริมาณและวิเคราะห์กรดนิวคลีอิกของเชื้อรา โดยใช้ PCR เพื่อตรวจจับดีเอ็นเอของเชื้อรา และการหาลำดับดีเอ็นเอของบริเวณที่อนุรักษ์ไว้ เช่น internal transcribed spacer เพื่อระบุสิ่งมีชีวิตถึงระดับสกุลหรือชนิด

Scope

หัวข้อนี้ครอบคลุมถึง PCR แบบจำเพาะต่อชนิด (species-specific) และแบบครอบคลุมหลายชนิด (broad-range หรือ panfungal) รวมถึง real-time PCR, การหาลำดับดีเอ็นเอของบริเวณบาร์โค้ด เช่น ITS และการใช้วิธีการเหล่านี้กับเชื้อที่แยกได้จากการเพาะเลี้ยงและโดยตรงกับวัสดุทางคลินิก รวมถึงเนื้อเยื่อที่ตรึงด้วยฟอร์มาลิน โดยนำเสนอวิธีการเหล่านี้ในฐานะวิธีการระบุและการตรวจจับ และไม่มีคำแนะนำในการทดสอบหรือการรักษา

Core questions

• มีดีเอ็นเอของเชื้อราอยู่ในสิ่งส่งตรวจนี้หรือไม่ และมาจากสิ่งมีชีวิตชนิดใด?
• เมื่อใดที่ PCR แบบ panfungal แบบครอบคลุมหลายชนิดดีกว่าการทดสอบแบบจำเพาะต่อชนิด?
• บริเวณจีโนมใดที่สามารถแยกแยะเชื้อราที่สนใจได้ดีที่สุด?
• จะตีความผลลัพธ์ทางโมเลกุลอย่างไรเมื่อพิจารณาถึงความเสี่ยงของการปนเปื้อนและการตรวจพบดีเอ็นเอที่ไม่สามารถมีชีวิตได้?

Key concepts

• ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส (PCR)
• PCR แบบจำเพาะต่อชนิดเทียบกับแบบครอบคลุมหลายชนิด (panfungal)
• Real-time (quantitative) PCR
• Internal transcribed spacer (ITS) ในฐานะบาร์โค้ดของเชื้อรา
• การหาลำดับดีเอ็นเอและฐานข้อมูลอ้างอิง
• การตรวจจับบนเชื้อที่แยกได้เทียบกับการตรวจโดยตรงบนเนื้อเยื่อ
• การควบคุมการปนเปื้อนและการตีความดีเอ็นเออิสระจากเซลล์

Mechanisms

PCR ใช้ไพรเมอร์และเอนไซม์โพลีเมอเรสที่ทนความร้อนเพื่อเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอเป้าหมายผ่านวัฏจักรซ้ำๆ ทำให้เกิดสำเนาจำนวนมากพอที่จะตรวจจับแม้กระทั่งสารพันธุกรรมของเชื้อราในปริมาณน้อย การทดสอบแบบจำเพาะต่อชนิดจะมุ่งเป้าไปที่สิ่งมีชีวิตที่ทราบ ในขณะที่การทดสอบแบบครอบคลุมหลายชนิดหรือ panfungal ใช้ไพรเมอร์ที่จับกับบริเวณที่อนุรักษ์ไว้ซึ่งพบในเชื้อราหลายชนิด หลังจากนั้นการหาลำดับเบสจะเปิดเผยเอกลักษณ์ บริเวณ internal transcribed spacer ของกลุ่มยีน ribosomal RNA ซึ่งมีไพรเมอร์ที่อนุรักษ์ไว้ซึ่งอธิบายโดย White และคณะ มีความแปรผันมากพอระหว่างชนิดเพื่อทำหน้าที่เป็นบาร์โค้ดสากลของเชื้อรา และลำดับที่อ่านได้จะถูกจับคู่กับฐานข้อมูลอ้างอิงเพื่อระบุชื่อสิ่งมีชีวิต Real-time PCR เพิ่มความสามารถในการหาปริมาณและความเร็ว และการทดสอบสามารถทำได้กับเชื้อที่แยกได้จากการเพาะเลี้ยงหรือโดยตรงกับสิ่งส่งตรวจทางคลินิก รวมถึงเนื้อเยื่อที่ตรึงด้วยฟอร์มาลิน แม้ว่าดีเอ็นเอที่เสื่อมสภาพและการปนเปื้อนจากสิ่งแวดล้อมจะทำให้การตีความซับซ้อน เนื่องจาก PCR ตรวจจับดีเอ็นเอมากกว่าเซลล์ที่มีชีวิต ผลลัพธ์จึงต้องอ่านร่วมกับการเพาะเลี้ยง การตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์ และการตรวจหาแอนติเจน

Clinical relevance

การตรวจจับและการหาลำดับเบสด้วยวิธีโมเลกุลมีบทบาทสำคัญมากขึ้นในการระบุเชื้อราและการรับรู้การติดเชื้อบางชนิด และผลลัพธ์ PCR บางอย่างมีส่วนช่วยในการจัดหมวดหมู่ที่เป็นที่ยอมรับของการติดเชื้อราแบบรุกรานที่น่าจะเป็นไปได้ บทความนี้อธิบายวิธีการและข้อควรระวังในการตีความในฐานะเอกสารอ้างอิง และไม่ได้ชี้นำการทดสอบหรือการดูแลผู้ป่วย

Evidence & guidelines

คำจำกัดความที่เป็นที่ยอมรับจาก EORTC/MSGERC ได้รวมผลลัพธ์ PCR ที่ระบุไว้ในเกณฑ์ทางจุลชีววิทยาสำหรับการติดเชื้อราแบบรุกรานที่น่าจะเป็นไปได้ ซึ่งสะท้อนถึงความก้าวหน้าของวิธีการทางโมเลกุล ในขณะที่คำแนะนำแนวปฏิบัติที่ดีที่สุดอธิบายถึงตำแหน่งของวิธีการเหล่านี้ควบคู่ไปกับการเพาะเลี้ยงและการทดสอบแอนติเจน แนวทางการหาลำดับ ITS มีที่มาจากไพรเมอร์ที่ใช้กันอย่างแพร่หลายซึ่งตีพิมพ์โดย White และคณะ

History

หลังจากที่มีการพัฒนาปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสในทศวรรษ 1980 การประยุกต์ใช้กับเชื้อราก็ก้าวหน้าอย่างรวดเร็วเมื่อ White และคณะได้ตีพิมพ์ไพรเมอร์สำหรับการเพิ่มปริมาณและหาลำดับยีน ribosomal RNA ของเชื้อราโดยตรงในปี 1990 ซึ่งทำให้บริเวณ ITS กลายเป็นเครื่องหมายทางสายวิวัฒนาการและต่อมาเป็นเครื่องหมายวินิจฉัย Real-time PCR, การทดสอบ panfungal แบบครอบคลุมหลายชนิด และการหาลำดับเบสแบบ high-throughput ได้ขยายขอบเขตของอณูวิทยาเชื้อราจากการวิจัยไปสู่การระบุและการตรวจจับตามปกติ

Seminal works

• white-1990
• donnelly-2020

Frequently asked questions

บริเวณ ITS คืออะไร และเหตุใดจึงใช้ในการระบุเชื้อรา?

internal transcribed spacer (ITS) เป็นส่วนหนึ่งของกลุ่มยีนไรโบโซมของเชื้อราที่มีความแปรผันมากพอระหว่างชนิด ในขณะที่ถูกขนาบข้างด้วยลำดับที่อนุรักษ์ไว้ ทำให้เป็นบาร์โค้ดสากลที่ใช้งานได้จริงสำหรับการระบุเชื้อราโดยอาศัยการหาลำดับเบส

ผล PCR เชื้อราที่เป็นบวกพิสูจน์ว่ามีการติดเชื้อที่กำลังดำเนินอยู่หรือไม่?

ไม่เสมอไป PCR ตรวจจับดีเอ็นเอของเชื้อรา ซึ่งสามารถคงอยู่ได้หลังจากที่สิ่งมีชีวิตไม่สามารถมีชีวิตอยู่ได้แล้ว หรือเกิดจากการปนเปื้อน ดังนั้นผลลัพธ์ทางโมเลกุลจึงต้องตีความควบคู่ไปกับการเพาะเลี้ยง การตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์ และการทดสอบแอนติเจน และอยู่ภายใต้คำจำกัดความการวินิจฉัยที่เป็นมาตรฐาน