เทคนิคการวินิจฉัยระดับโมเลกุล

เทคนิคการวินิจฉัยระดับโมเลกุลตรวจหาปรสิตโดยการเพิ่มปริมาณและระบุรหัสพันธุกรรมของปรสิต ซึ่งให้ความไวในการวิเคราะห์สูงและความสามารถในการจำแนกชนิด สายพันธุ์ และการติดเชื้อแบบผสมที่การตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์และซีโรโลยีอาจตรวจไม่พบ ในปรสิตวิทยา วิธีการเหล่านี้มีตั้งแต่ PCR แบบดั้งเดิมและแบบเรียลไทม์ ไปจนถึงรูปแบบการเพิ่มปริมาณแบบไอโซเทอร์มอลที่ออกแบบมาสำหรับการใช้งาน ณ จุดดูแลในสถานการณ์ที่มีทรัพยากรจำกัด

Definition

เทคนิคการวินิจฉัยระดับโมเลกุลในปรสิตวิทยาเป็นวิธีการทางห้องปฏิบัติการที่ตรวจหาและจำแนกปรสิตโดยการเพิ่มปริมาณและระบุลำดับกรดนิวคลีอิกจำเพาะของปรสิต โดยใช้ PCR และเคมีของการเพิ่มปริมาณที่เกี่ยวข้อง เพื่อยืนยันการติดเชื้อ จำแนกชนิด และตรวจหาการติดเชื้อที่มีความหนาแน่นต่ำหรือการติดเชื้อแบบผสม

Scope

หัวข้อนี้ครอบคลุมการตรวจหาปรสิตโดยอาศัยกรดนิวคลีอิกในปรสิตวิทยา: ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส (polymerase chain reaction) และรูปแบบเรียลไทม์และเนสเต็ด (nested variants) วิธีการไอโซเทอร์มอล เช่น การเพิ่มปริมาณแบบไอโซเทอร์มอลที่อาศัยลูป (loop-mediated isothermal amplification (LAMP)) และการใช้เครื่องมือเหล่านี้สำหรับการจำแนกชนิด การตรวจหาความหนาแน่นต่ำ และการระบุการติดเชื้อแบบผสมหรือแบบซ่อนเร้น หัวข้อนี้ถือว่าการตรวจหาระดับโมเลกุลเป็นระเบียบวิธีวินิจฉัย และไม่ได้ให้โปรโตคอลการทดสอบทางคลินิกหรือการรักษา สำหรับการวินิจฉัยระดับโมเลกุลในบริบทของแบคทีเรียวิทยา โปรดดูโหนดที่เกี่ยวข้อง

Core questions

• การเพิ่มปริมาณกรดนิวคลีอิกบรรลุความไวที่เหนือกว่าการตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์และการทดสอบแอนติเจนได้อย่างไร?
• การจำแนกชนิดและสายพันธุ์เปลี่ยนแปลงข้อสรุปการวินิจฉัยหรือระบาดวิทยาเมื่อใด?
• อะไรที่ทำให้วิธีการไอโซเทอร์มอล เช่น LAMP เหมาะสำหรับการใช้งาน ณ จุดดูแลและภาคสนาม?
• การตรวจหา DNA ของปรสิตควรตีความอย่างไรเมื่อเทียบกับการติดเชื้อที่ยังมีชีวิตและมีการเคลื่อนไหว?

Key concepts

• ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส (PCR)
• Nested และ real-time (quantitative) PCR
• การเพิ่มปริมาณแบบไอโซเทอร์มอลที่อาศัยลูป (LAMP)
• การจำแนกชนิดและสายพันธุ์
• การตรวจหาการติดเชื้อแบบผสมและความหนาแน่นต่ำ
• ความไวและความจำเพาะในการวิเคราะห์
• การตรวจหา DNA เทียบกับการมีชีวิตของสิ่งมีชีวิต

Mechanisms

วิธีการเหล่านี้ใช้การจดจำลำดับจำเพาะของ DNA ปรสิต ใน PCR เอนไซม์โพลีเมอเรสที่ทนความร้อนและไพรเมอร์ที่ขนาบลำดับเป้าหมายจะขับเคลื่อนการเพิ่มปริมาณแบบทวีคูณผ่านวงจรการแยกสาย DNA การจับคู่ และการขยายสาย DNA ซ้ำๆ ทำให้สามารถตรวจพบแม้กระทั่งสำเนาเริ่มต้นจำนวนน้อยมากได้; nested PCR เพิ่มคู่ไพรเมอร์ที่สองเพื่อเพิ่มความไวและความจำเพาะ และ real-time PCR จะวัดปริมาณการเพิ่มปริมาณในขณะที่ดำเนินไป วิธีการไอโซเทอร์มอล เช่น LAMP บรรลุการเพิ่มปริมาณที่อุณหภูมิเดียวโดยใช้ไพรเมอร์หลายตัวและเอนไซม์โพลีเมอเรสที่เคลื่อนย้ายสาย DNA ทำให้ไม่จำเป็นต้องมีการวนรอบอุณหภูมิและช่วยให้รูปแบบการใช้งานง่ายขึ้นและสามารถนำไปใช้ภาคสนามได้ เนื่องจากเป้าหมายของการเพิ่มปริมาณคือกรดนิวคลีอิกมากกว่าสิ่งมีชีวิตที่ยังมีชีวิตอยู่ ผลบวกจึงต้องตีความด้วยข้อควรระวังว่า DNA ที่ตกค้างอาจยังคงอยู่หลังจากปรสิตไม่สามารถมีชีวิตอยู่ได้อีกต่อไป

Clinical relevance

เทคนิคระดับโมเลกุลช่วยปรับปรุงการตรวจหาการติดเชื้อที่มีความหนาแน่นต่ำและการติดเชื้อแบบผสม และช่วยให้สามารถระบุชนิดและสายพันธุ์ที่ชี้นำการเฝ้าระวังและการจำแนกลักษณะของกรณีได้ ข้อมูลนี้อธิบายวิธีการและข้อจำกัดในการตีความในฐานะหลักฐาน และไม่ใช่สิ่งทดแทนโปรโตคอลทางห้องปฏิบัติการหรือการตัดสินใจทางคลินิก

Epidemiology

ด้วยการตรวจหาการติดเชื้อที่ต่ำกว่าเกณฑ์การมองเห็นด้วยกล้องจุลทรรศน์และการแยกแยะการติดเชื้อแบบผสม วิธีการระดับโมเลกุลได้ปรับปรุงการประมาณการของการพาหะปรสิตแบบ submicroscopic ในมาลาเรียและการติดเชื้ออื่นๆ ซึ่งให้ข้อมูลแก่แบบจำลองการแพร่เชื้อและการประเมินโครงการควบคุม; รูปแบบไอโซเทอร์มอลกำลังได้รับการสำรวจมากขึ้นสำหรับการทดสอบแบบกระจายอำนาจในพื้นที่ที่มีการระบาดและมีทรัพยากรจำกัด

History

การนำ PCR โดยใช้เอนไซม์โพลีเมอเรสที่ทนความร้อนโดย Saiki และคณะในปี 1988 ทำให้การเพิ่มปริมาณกรดนิวคลีอิกเป็นไปได้ในทางปฏิบัติ และถูกนำมาใช้กับปรสิตในเวลาไม่นานหลังจากนั้น โดยการทดสอบ nested-PCR ได้เพิ่มความไวในการตรวจหามาลาเรียอย่างมากในช่วงต้นทศวรรษ 1990 การอธิบายการเพิ่มปริมาณแบบไอโซเทอร์มอลที่อาศัยลูปในปี 2000 ได้เปิดเส้นทางสู่การวินิจฉัยระดับโมเลกุลที่ใช้เครื่องมือน้อยและสามารถทำได้ ณ จุดดูแล ซึ่งยังคงได้รับการพัฒนาสำหรับโรคปรสิต

Debates

การตรวจพบ DNA ของปรสิตพิสูจน์การติดเชื้อที่ยังคงดำเนินอยู่หรือไม่?

การเพิ่มปริมาณยืนยันการมีอยู่ของกรดนิวคลีอิกของปรสิต แต่ไม่สามารถยืนยันได้ด้วยตัวเองว่ามีสิ่งมีชีวิตที่ยังมีชีวิตอยู่ เนื่องจาก DNA ที่ตกค้างอาจยังคงอยู่หลังจากการกำจัด; สิ่งนี้ทำให้การใช้ผลบวกทางโมเลกุลเป็นตัวบ่งชี้การรักษาหายมีความซับซ้อน

Seminal works

• saiki-1988
• notomi-2000
• snounou-1993

Frequently asked questions

เหตุใดการทดสอบระดับโมเลกุลจึงมักมีความไวมากกว่าการตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์?

การเพิ่มปริมาณสามารถเพิ่มจำนวนสำเนา DNA ของปรสิตเพียงไม่กี่สำเนาให้เป็นสัญญาณที่ตรวจจับได้ ดังนั้นการติดเชื้อที่มีความหนาแน่นของปรสิตต่ำมากที่การตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์อาจพลาดไปก็ยังสามารถตรวจพบและระบุชนิดได้

LAMP มีข้อดีอะไรเหนือ PCR แบบดั้งเดิม?

LAMP เพิ่มปริมาณ DNA ที่อุณหภูมิคงที่เพียงอุณหภูมิเดียวโดยไม่ต้องใช้เครื่องควบคุมอุณหภูมิ ทำให้ง่ายขึ้น เร็วขึ้น และเหมาะสำหรับการใช้งาน ณ จุดดูแลและภาคสนามมากขึ้น แม้ว่าการออกแบบและการตีความการทดสอบยังคงต้องใช้ความระมัดระวัง