ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสและการเพิ่มปริมาณกรดนิวคลีอิก

ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส — วิธีการแบบวนซ้ำที่ใช้ไพรเมอร์เป็นตัวนำในการคัดลอกส่วนของ DNA ที่เลือกไว้แบบทวีคูณ — และเทคนิคการเพิ่มปริมาณที่กว้างขึ้นซึ่งพัฒนาต่อยอดจากหลักการนี้

Definition

ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสเป็นวิธีการในหลอดทดลองที่เพิ่มปริมาณบริเวณ DNA ที่กำหนดไว้แบบทวีคูณโดยการวนซ้ำของการแยกสาย, การจับคู่ของไพรเมอร์ที่ขนาบข้าง, และการยืดสายโดยเอนไซม์ DNA โพลีเมอเรสที่ทนความร้อน; การเพิ่มปริมาณกรดนิวคลีอิกโดยรวมครอบคลุมเทคนิคที่เกี่ยวข้องสำหรับการคัดลอกลำดับ DNA หรือ RNA

Scope

หัวข้อนี้ครอบคลุมหลักการและรูปแบบต่างๆ ของการเพิ่มปริมาณกรดนิวคลีอิก: การวนรอบอุณหภูมิของการแยกสาย, การจับคู่ของไพรเมอร์, และการยืดสายที่กำหนดปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส; บทบาทของไพรเมอร์และเอนไซม์โพลีเมอเรสที่ทนความร้อน; และการต่อยอด เช่น การเพิ่มปริมาณแบบย้อนกลับ (reverse-transcription) และการเพิ่มปริมาณเชิงปริมาณแบบเรียลไทม์ (quantitative real-time amplification) โดยจะกล่าวถึงวิธีการและตรรกะของมัน; ส่วนการหาลำดับและการโคลนที่ใช้ DNA ที่เพิ่มปริมาณแล้วจะครอบคลุมในหัวข้อที่เกี่ยวข้อง

Core questions

• การวนรอบของการให้ความร้อนและความเย็นซ้ำๆ เพิ่มปริมาณบริเวณ DNA ที่จำเพาะได้อย่างไร?
• เหตุใดไพรเมอร์สองตัวและเอนไซม์โพลีเมอเรสที่ทนความร้อนจึงจำเป็น?
• การเพิ่มปริมาณกลายเป็นแบบทวีคูณได้อย่างไร?
• วิธีการนี้ถูกต่อยอดเพื่อหาปริมาณกรดนิวคลีอิกหรือเพื่อเพิ่มปริมาณ RNA ได้อย่างไร?

Key theories

การเพิ่มปริมาณแบบทวีคูณที่กำหนดโดยไพรเมอร์

ไพรเมอร์คู่หนึ่งที่ขนาบข้างเป้าหมายจะกำหนดบริเวณที่ถูกเพิ่มปริมาณ และเนื่องจากแต่ละสายใหม่ทำหน้าที่เป็นแม่แบบในรอบถัดไป จำนวนสำเนาของเป้าหมายจึงเพิ่มขึ้นประมาณสองเท่าต่อรอบ โดยเติบโตแบบทวีคูณ

เอนไซม์โพลีเมอเรสที่ทนความร้อนช่วยให้เกิดการวนรอบ

การใช้เอนไซม์ DNA โพลีเมอเรสที่ทนความร้อนช่วยให้สามารถแยกสายด้วยอุณหภูมิสูงซ้ำๆ โดยไม่ต้องเติมเอนไซม์ใหม่ ทำให้การวนรอบอุณหภูมิแบบอัตโนมัติเป็นไปได้จริงและปฏิกิริยามีความเสถียร

Mechanisms

แต่ละรอบจะให้ความร้อนแก่ตัวอย่างเพื่อแยกสาย DNA, ทำให้เย็นลงเพื่อให้ไพรเมอร์สองตัวจับคู่กับลำดับที่ขนาบข้างเป้าหมายบนสายตรงข้าม, และทำให้ร้อนขึ้นถึงอุณหภูมิการยืดสายที่เอนไซม์โพลีเมอเรสที่ทนความร้อนจะสังเคราะห์สายใหม่จากไพรเมอร์ เนื่องจากผลิตภัณฑ์ของรอบหนึ่งเป็นแม่แบบสำหรับรอบถัดไป บริเวณเป้าหมายจึงถูกเพิ่มปริมาณแบบทวีคูณตลอดหลายรอบ รูปแบบต่างๆ ได้แก่ การเพิ่มปริมาณแบบย้อนกลับ (reverse-transcription amplification) ซึ่งคัดลอก RNA เป็น DNA ก่อน, และการเพิ่มปริมาณเชิงปริมาณแบบเรียลไทม์ (real-time quantitative amplification) ซึ่งตรวจสอบการสะสมของผลิตภัณฑ์เพื่อวัดปริมาณเริ่มต้น

Clinical relevance

การเพิ่มปริมาณเป็นหัวใจสำคัญของการทดสอบทางพันธุกรรม, การตรวจจับเชื้อโรค, และการระบุตัวตนทางนิติวิทยาศาสตร์; นำเสนอในฐานะความสำคัญมากกว่าคำแนะนำทางคลินิก

History

มัลลิส (Mullis) คิดค้นปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสในช่วงต้นทศวรรษ 1980 และรายงานในปี 1985 โดยไซกิ (Saiki) และคณะได้แสดงให้เห็นถึงการใช้งาน โดยการนำเอนไซม์โพลีเมอเรสที่ทนความร้อนมาใช้ในภายหลังทำให้เป็นวิธีการที่ใช้กันทั่วไป; การประดิษฐ์นี้ได้รับการยอมรับด้วยรางวัลโนเบลสาขาเคมีในปี 1993

Key figures

• Kary Mullis
• Randall Saiki
• Henry Erlich

Seminal works

• saiki1985
• lodish2016

Frequently asked questions

เหตุใด PCR จึงต้องการไพรเมอร์?

ไพรเมอร์กำหนดจุดเริ่มต้นของการสังเคราะห์บนแต่ละสาย ดังนั้นจึงกำหนดว่าบริเวณใดจะถูกคัดลอกและช่วยให้เอนไซม์โพลีเมอเรสเริ่มต้นการยืดสายได้

อะไรที่ทำให้การเพิ่มปริมาณเป็นแบบทวีคูณ?

สายใหม่ของแต่ละรอบจะกลายเป็นแม่แบบในรอบถัดไป ดังนั้นจำนวนสำเนาของเป้าหมายจึงเพิ่มขึ้นประมาณสองเท่าในทุกรอบ