เทคนิคการวินิจฉัยระดับโมเลกุล

เทคนิคการวินิจฉัยระดับโมเลกุลตรวจจับและจำแนกแบคทีเรียจากกรดนิวคลีอิกของพวกมัน แทนที่จะใช้การเพาะเลี้ยง โดยใช้วิธีการต่างๆ เช่น ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสและการหาลำดับสารพันธุกรรม วิธีการเหล่านี้สามารถระบุสิ่งมีชีวิตได้โดยตรงจากตัวอย่าง ซึ่งมักจะเร็วกว่าการเพาะเลี้ยง และบางครั้งก็สามารถทำได้เมื่อการเพาะเลี้ยงล้มเหลว อีกทั้งยังสามารถตรวจจับปัจจัยที่ทำให้เกิดการดื้อยาได้

Definition

เทคนิคการวินิจฉัยระดับโมเลกุลเป็นวิธีการทางห้องปฏิบัติการที่ตรวจจับ, เพิ่มจำนวน, หรือหาลำดับกรดนิวคลีอิกของจุลินทรีย์เพื่อระบุสิ่งมีชีวิตหรือปัจจัยที่ทำให้เกิดการดื้อยา โดยทั่วไปแล้วไม่จำเป็นต้องเพาะเลี้ยงสิ่งมีชีวิตนั้น

Scope

หัวข้อนี้ครอบคลุมการทดสอบการเพิ่มจำนวนกรดนิวคลีอิก, ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสแบบเรียลไทม์และแบบมัลติเพล็กซ์, การระบุชนิดโดยอาศัยการหาลำดับสารพันธุกรรม, และแผงโมเลกุลสำหรับกลุ่มอาการต่างๆ พร้อมทั้งจุดแข็งและข้อควรระวังในการตีความ หัวข้อนี้ถูกกำหนดให้เป็นเรื่องของระเบียบวิธีวิจัยและไม่ได้ให้คำแนะนำในการทดสอบหรือการรักษาสำหรับผู้ป่วยแต่ละราย

Core questions

• การทดสอบการเพิ่มจำนวนกรดนิวคลีอิกตรวจจับแบคทีเรียได้อย่างไร?
• เมื่อใดที่วิธีการทางโมเลกุลสามารถประสบความสำเร็จได้ในขณะที่การเพาะเลี้ยงล้มเหลว และข้อจำกัดของมันคืออะไร?
• การวินิจฉัยระดับโมเลกุลและการวินิจฉัยโดยการเพาะเลี้ยงเสริมซึ่งกันและกันได้อย่างไร?

Key concepts

• การทดสอบการเพิ่มจำนวนกรดนิวคลีอิก
• PCR แบบเรียลไทม์ (เชิงปริมาณ)
• แผงมัลติเพล็กซ์และแผงสำหรับกลุ่มอาการ
• การหาลำดับยีน 16S rRNA
• การตรวจหายีนดื้อยา
• การตรวจหาสิ่งมีชีวิตที่ไม่สามารถมีชีวิตอยู่ได้
• ความไวและความจำเพาะในการวิเคราะห์

Mechanisms

วิธีการทางโมเลกุลจะกำหนดเป้าหมายลำดับกรดนิวคลีอิกที่เฉพาะเจาะจงและเพิ่มจำนวนมัน เพื่อให้สามารถตรวจจับสิ่งมีชีวิตได้แม้ในปริมาณน้อย รูปแบบเรียลไทม์จะวัดปริมาณเป้าหมายและลดระยะเวลาการทำงานลง ในขณะที่แผงมัลติเพล็กซ์จะทดสอบเชื้อโรคหลายชนิดพร้อมกัน (Espy 2006) การหาลำดับยีนที่อนุรักษ์ไว้ เช่น 16S rRNA สามารถระบุสิ่งมีชีวิตที่ยากต่อการเพาะเลี้ยงหรือการจำแนกลักษณะฟีโนไทป์ได้ เนื่องจากวิธีการเหล่านี้ตรวจจับกรดนิวคลีอิกแทนที่จะเป็นการเจริญเติบโต จึงสามารถให้ผลลัพธ์ได้เมื่อการเพาะเลี้ยงเป็นลบ รวมถึงหลังจากได้รับยาปฏิชีวนะ แต่ก็อาจตรวจพบสิ่งมีชีวิตที่ไม่สามารถมีชีวิตอยู่ได้หรือสิ่งมีชีวิตที่อาศัยอยู่ตามปกติ ดังนั้นผลลัพธ์จึงต้องได้รับการตีความตามบริบท บทวิจารณ์ต่างๆ อธิบายว่าการวินิจฉัยระดับโมเลกุลได้ปรับปรุงความเร็วและความไวในขณะที่ก่อให้เกิดคำถามใหม่ๆ ในการตีความ (Espy 2006; Caliendo 2013)

Clinical relevance

การวินิจฉัยระดับโมเลกุลมีอิทธิพลต่อความรวดเร็วและความน่าเชื่อถือในการระบุเชื้อที่เป็นสาเหตุของการติดเชื้อ และการตรวจจับการดื้อยา แต่การตีความผลลัพธ์จะแตกต่างจากการเพาะเลี้ยง เนื่องจาก การตรวจพบยีนไม่เหมือนกับการแยกเชื้อที่สามารถมีชีวิตอยู่ได้และสามารถทดสอบความไวต่อยาได้ หัวข้อนี้อธิบายถึงวิธีการสร้างหลักฐานทางห้องปฏิบัติการและไม่ใช่พื้นฐานสำหรับการตัดสินใจในการวินิจฉัยหรือการรักษาเฉพาะบุคคล

Evidence & guidelines

บทวิจารณ์ที่ครอบคลุมได้อธิบายถึงการประยุกต์ใช้และประสิทธิภาพของ PCR แบบเรียลไทม์และวิธีการทางโมเลกุลอื่นๆ ในจุลชีววิทยาคลินิกประจำวัน (Espy 2006) และการเปลี่ยนแปลงที่กว้างขึ้นไปสู่การวินิจฉัยโรคติดเชื้อที่ดีขึ้น (Caliendo 2013); ตำรามาตรฐานได้ให้รายละเอียดเกี่ยวกับวิธีการทางโมเลกุลและตำแหน่งของมันควบคู่ไปกับการเพาะเลี้ยง (Jorgensen 2015)

History

ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส ซึ่งนำมาใช้ในช่วงทศวรรษ 1980 ทำให้การตรวจจับกรดนิวคลีอิกแบบเฉพาะเจาะจงเป็นไปได้ในทางปฏิบัติ และรูปแบบเรียลไทม์และมัลติเพล็กซ์ได้ถูกนำมาใช้ในห้องปฏิบัติการทางคลินิกทั่วไปในเวลาต่อมา ซึ่งเป็นการขยายการวินิจฉัยระดับโมเลกุลและการระบุชนิดโดยอาศัยลำดับสารพันธุกรรม (Espy 2006; Caliendo 2013)

Seminal works

• espy-2006
• caliendo-2013

Frequently asked questions

การทดสอบระดับโมเลกุลสามารถทดแทนการเพาะเลี้ยงได้หรือไม่?

ไม่ทั้งหมด; บ่อยครั้งที่พวกมันตรวจจับสิ่งมีชีวิตได้เร็วกว่า และบางครั้งก็สามารถทำได้เมื่อการเพาะเลี้ยงล้มเหลว แต่การเพาะเลี้ยงยังคงให้เชื้อที่สามารถมีชีวิตอยู่ได้สำหรับการจำแนกลักษณะเพิ่มเติม และผลลัพธ์ระดับโมเลกุลที่ตรวจพบกรดนิวคลีอิกจำเป็นต้องได้รับการตีความอย่างระมัดระวัง

เหตุใดการทดสอบระดับโมเลกุลจึงอาจให้ผลบวกในขณะที่การเพาะเลี้ยงให้ผลลบ?

วิธีการทางโมเลกุลตรวจจับกรดนิวคลีอิกแทนที่จะเป็นการเจริญเติบโต ดังนั้นจึงสามารถให้ผลบวกได้เมื่อสิ่งมีชีวิตไม่สามารถมีชีวิตอยู่ได้หรือมีจำนวนน้อย รวมถึงหลังจากได้รับยาปฏิชีวนะที่ป้องกันการฟื้นตัวจากการเพาะเลี้ยง