ระเบียบวิธีการหาลำดับดีเอ็นเอและอาร์เอ็นเอ
ระเบียบวิธีการหาลำดับนิวคลีโอไทด์เป็นการระบุลำดับที่แน่นอนของนิวคลีโอไทด์ในดีเอ็นเอ หรือในอาร์เอ็นเอหลังจากการแปลง เทคนิคเหล่านี้ช่วยให้พยาธิวิทยาโมเลกุลสามารถอ่านยีนทีละเบส ตรวจจับการกลายพันธุ์ และสร้างโปรไฟล์การแสดงออกของยีนในระดับใหญ่ได้ ตั้งแต่เคมีของการยุติสายโซ่ของแซงเกอร์ไปจนถึงแพลตฟอร์มรุ่นใหม่ที่ทำงานแบบขนานจำนวนมาก
Definition
ระเบียบวิธีการหาลำดับดีเอ็นเอและอาร์เอ็นเอเป็นเทคนิคทางห้องปฏิบัติการที่อ่านลำดับเชิงเส้นของเบสนิวคลีโอไทด์ในโมเลกุลกรดนิวคลีอิก โดยทั่วไปแล้ว อาร์เอ็นเอจะถูกถอดรหัสย้อนกลับเป็นดีเอ็นเอสายสมบูรณ์ก่อนการหาลำดับ
Scope
หัวข้อนี้ครอบคลุมการหาลำดับรุ่นแรก (แซงเกอร์) การหาลำดับรุ่นใหม่ (แบบขนานจำนวนมาก) และการหาลำดับอาร์เอ็นเอสำหรับการวิเคราะห์ทรานสคริปโตม รวมถึงขั้นตอนการทำงานทั่วไปของการเตรียมไลบรารี การหาลำดับ และการจัดเรียงลำดับที่อ่านได้ โดยนำเสนอในฐานะเอกสารอ้างอิงระเบียบวิธีวิจัยมากกว่าคำแนะนำการทดสอบทางคลินิก
Key concepts
- การหาลำดับแบบยุติสายโซ่ (แซงเกอร์)
- การหาลำดับรุ่นใหม่ / แบบขนานจำนวนมาก
- การเตรียมไลบรารี
- ลำดับที่อ่านได้จากการหาลำดับและขอบเขตครอบคลุม
- การจัดเรียงลำดับที่อ่านได้และการระบุความแปรผัน
- การหาลำดับอาร์เอ็นเอ (ทรานสคริปโตมิกส์)
- การหาลำดับแบบกำหนดเป้าหมาย, เอ็กโซม, และจีโนมทั้งหมด
Mechanisms
การหาลำดับแบบแซงเกอร์จะรวมไดดีออกซีนิวคลีโอไทด์ที่ยุติสายโซ่เพื่อสร้างชิ้นส่วนที่มีความยาวต่างกัน ซึ่งจะถูกแยกตามขนาดเพื่อสร้างลำดับขึ้นใหม่ (Sanger et al., 1977) ในทางกลับกัน การหาลำดับรุ่นใหม่จะเตรียมไลบรารีของดีเอ็นเอที่ถูกตัดเป็นชิ้นเล็กๆ ขยายในเชิงพื้นที่ และหาลำดับชิ้นส่วนหลายล้านชิ้นพร้อมกัน โดยอ่านส่วนสั้นๆ ที่สัญญาณจะถูกประกอบเข้าด้วยกันด้วยคอมพิวเตอร์ (Margulies et al., 2005; Goodwin et al., 2016) การหาลำดับอาร์เอ็นเอใช้วิธีการแบบขนานเดียวกันกับดีเอ็นเอสายสมบูรณ์ที่ได้จากอาร์เอ็นเอ โดยวัดปริมาณทรานสคริปต์และเผยให้เห็นรูปแบบการต่อเชื่อมและการแสดงออก (Wang et al., 2009) ลำดับที่อ่านได้จะถูกจัดเรียงกับลำดับอ้างอิงเพื่อระบุความแปรผันหรือวัดปริมาณ
Clinical relevance
การหาลำดับสนับสนุนการตรวจจับความแปรผันที่เกี่ยวข้องกับโรคและการจำแนกลักษณะทางโมเลกุลของเนื้องอกและเชื้อโรค บทความนี้อธิบายว่าวิธีการสร้างข้อมูลลำดับได้อย่างไรและมีวัตถุประสงค์เพื่อเป็นข้อมูลอ้างอิง โดยไม่ได้ให้คำแนะนำในการเลือก การตีความ หรือการดำเนินการกับการทดสอบการหาลำดับในการดูแลผู้ป่วยแต่ละราย
Evidence & guidelines
วิธีการเหล่านี้ตั้งอยู่บนพื้นฐานของวรรณกรรมปฐมภูมิที่สำคัญ ตั้งแต่วิธีการยุติสายโซ่ของแซงเกอร์ในปี 1977 ไปจนถึงแพลตฟอร์มปิโคลิตรที่มีปริมาณงานสูงเป็นครั้งแรก (Margulies et al., 2005) และลำดับจีโนมมนุษย์ (Venter et al., 2001) โดยมีการทบทวนในภายหลังที่สำรวจเทคโนโลยีรุ่นใหม่ตลอดทศวรรษและการเพิ่มขึ้นของ RNA-Seq (Goodwin et al., 2016; Wang et al., 2009)
History
วิธีการยุติสายโซ่ของแซงเกอร์ (1977) ทำให้การหาลำดับดีเอ็นเอเป็นเรื่องปกติและเป็นพื้นฐานของการหาลำดับจีโนมมนุษย์ครั้งแรก (Venter et al., 2001) การนำเสนอการหาลำดับแบบขนานจำนวนมากในช่วงกลางทศวรรษ 2000 ช่วยลดต้นทุนและเพิ่มปริมาณงานลงอย่างมาก (Margulies et al., 2005) และภายในหนึ่งทศวรรษ การหาลำดับรุ่นใหม่และ RNA-Seq ได้กลายเป็นเครื่องมือมาตรฐานสำหรับจีโนมิกส์และทรานสคริปโตมิกส์ (Goodwin et al., 2016; Wang et al., 2009)
Key figures
- Frederick Sanger
- J. Craig Venter
- Marcel Margulies
Related topics
Seminal works
- sanger-1977
- margulies-2005
- goodwin-2016
Frequently asked questions
- การหาลำดับรุ่นใหม่แตกต่างจากการหาลำดับแบบแซงเกอร์อย่างไร?
- การหาลำดับแบบแซงเกอร์จะอ่านชิ้นส่วนดีเอ็นเอทีละชิ้นโดยใช้เคมีแบบยุติสายโซ่ ในขณะที่การหาลำดับรุ่นใหม่จะอ่านชิ้นส่วนหลายล้านชิ้นพร้อมกันในลักษณะขนานจำนวนมาก ซึ่งช่วยเพิ่มปริมาณงานและลดต้นทุนต่อเบสได้อย่างมาก
- สามารถหาลำดับอาร์เอ็นเอได้โดยตรงหรือไม่?
- โดยทั่วไปแล้ว อาร์เอ็นเอจะถูกแปลงเป็นดีเอ็นเอสายสมบูรณ์ก่อนโดยการถอดรหัสย้อนกลับแล้วจึงหาลำดับ วิธีการ RNA-Seq นี้จะวัดปริมาณทรานสคริปต์และเผยให้เห็นรูปแบบการต่อเชื่อมและการแสดงออก