Análise Quantitativa em Tempo Real e Avaliação do Número de Cópias

Os métodos moleculares quantitativos medem a quantidade de um ácido nucleico alvo presente, em vez de apenas verificar se ele é detectável. A PCR quantitativa em tempo real rastreia a amplificação à medida que ocorre, a PCR digital particiona uma amostra para contar as moléculas de forma absoluta, e a avaliação do número de cópias determina se uma região genômica foi ganha ou perdida.

Definition

A análise quantitativa em tempo real mede a quantidade de um ácido nucleico alvo, tipicamente monitorando o sinal fluorescente durante a amplificação (PCR em tempo real) ou contando partições positivas (PCR digital); a avaliação do número de cópias determina o número de cópias de uma região genômica em relação a uma referência.

Scope

O tópico abrange PCR em tempo real (quantitativa), PCR digital e PCR digital por gotas, e abordagens para avaliação do número de cópias. Ele aborda os princípios da quantificação e as considerações que tornam os resultados comparáveis, apresentados como material de referência metodológica, e não como orientação para testes clínicos.

Key concepts

• PCR em tempo real (quantitativa)
• Ciclo de quantificação (Cq) e eficiência de amplificação
• Curvas padrão e quantificação relativa
• PCR digital e PCR digital por gotas
• Quantificação absoluta por particionamento
• Ganhos e perdas do número de cópias
• Padrões de comunicação e reprodutibilidade

Mechanisms

A PCR em tempo real acopla a amplificação a um repórter fluorescente cujo sinal aumenta em proporção ao acúmulo do produto; o ciclo em que o sinal cruza um limiar reflete a quantidade inicial do alvo, permitindo quantificação relativa ou por curva padrão (Heid et al., 1996). A PCR digital, em vez disso, distribui a amostra em muitas pequenas partições, de modo que cada uma contenha zero ou poucas moléculas; a contagem da fração de partições positivas e a aplicação de estatísticas de Poisson fornecem uma contagem absoluta sem uma curva padrão (Hindson et al., 2011). A avaliação do número de cópias compara a abundância de uma região alvo com uma referência para detectar amplificações ou deleções, uma ideia pioneira da hibridização genômica comparativa (Kallioniemi et al., 1992).

Clinical relevance

Métodos quantitativos e de número de cópias são usados para medir a carga patogênica, a expressão gênica e ganhos ou perdas genômicas. Esta entrada explica como a quantificação funciona como uma referência metodológica; ela não aconselha sobre a seleção, interpretação ou ação em qualquer ensaio quantitativo específico no cuidado ao paciente.

Evidence & guidelines

A comunicação de PCR quantitativa é guiada pelas recomendações MIQE, que especificam as informações mínimas necessárias para publicação reprodutível (Bustin et al., 2009). Estudos primários fundamentais descrevem a quantificação em tempo real (Heid et al., 1996), a quantificação digital absoluta (Hindson et al., 2011) e a medição do número de cópias em todo o genoma (Kallioniemi et al., 1992).

History

A PCR em tempo real, em meados da década de 1990, transformou a amplificação de uma ferramenta qualitativa em uma quantitativa (Heid et al., 1996), e os padrões de comunicação de consenso surgiram uma década depois (Bustin et al., 2009). A PCR digital, e especialmente a PCR digital por gotas, então permitiu a contagem absoluta de moléculas com alta precisão (Hindson et al., 2011), enquanto a avaliação do número de cópias evoluiu da hibridização genômica comparativa para métodos baseados em arranjos e sequenciamento (Kallioniemi et al., 1992).

Key figures

• Christian Heid
• Stephen Bustin
• Benjamin Hindson

Seminal works

• heid-1996
• hindson-2011
• bustin-2009

Frequently asked questions

Como a PCR digital difere da PCR quantitativa em tempo real?

A PCR em tempo real estima a quantidade inicial do alvo a partir de quão cedo o sinal fluorescente cruza um limiar, geralmente em relação a um padrão, enquanto a PCR digital particiona a amostra e conta os compartimentos positivos para fornecer uma contagem absoluta de moléculas sem uma curva padrão.

O que a avaliação do número de cópias mede?

Ela determina quantas cópias de uma região genômica específica estão presentes em relação a uma referência, identificando amplificações (ganhos) ou deleções (perdas) dessa região.