PCR e Técnicas de Amplificação de Ácidos Nucleicos

As técnicas de amplificação de ácidos nucleicos copiam uma sequência de DNA ou RNA escolhida muitas vezes, de modo que um alvo presente em quantidades mínimas se torna detectável e mensurável. A reação em cadeia da polimerase (PCR) é o arquétipo: através de ciclos repetidos de desnaturação, anelamento de primers e extensão pela polimerase, ela produz um aumento exponencial em uma sequência definida, tornando-a um pilar do diagnóstico molecular.

Definition

As técnicas de amplificação de ácidos nucleicos são métodos in vitro que geram enzimaticamente muitas cópias de uma sequência específica de DNA ou RNA, com a PCR utilizando ciclagem térmica e uma DNA polimerase para amplificar uma região definida por dois primers.

Scope

O tópico abrange a PCR convencional de ponto final, a PCR em tempo real (quantitativa), a PCR de transcrição reversa para alvos de RNA e alternativas isotérmicas, como a amplificação isotérmica mediada por loop. Aborda os princípios, componentes e considerações de relatórios da amplificação como uma referência metodológica, não como protocolos de ensaio ou orientação clínica.

Key concepts

• Ciclagem térmica (desnaturação, anelamento, extensão)
• Primers e DNA polimerase
• Amplificação exponencial
• PCR de transcrição reversa para alvos de RNA
• PCR em tempo real (quantitativa)
• Amplificação isotérmica (por exemplo, LAMP)
• Controle de contaminação e falsos positivos

Mechanisms

Na PCR, o DNA de fita dupla é desnaturado pelo calor em fitas simples, primers de oligonucleotídeos curtos anelam-se a sequências que flanqueiam o alvo, e uma DNA polimerase termoestável estende os primers para sintetizar novas fitas complementares; a repetição do ciclo duplica o alvo a cada rodada, resultando em amplificação exponencial (Saiki et al., 1985; Mullis et al., 1986). Os alvos de RNA são primeiro convertidos em DNA complementar por transcriptase reversa antes da amplificação. A PCR em tempo real monitora o acúmulo de produto ciclo a ciclo usando repórteres fluorescentes, permitindo a quantificação (Heid et al., 1996). Métodos isotérmicos, como a amplificação isotérmica mediada por loop, amplificam a uma única temperatura, evitando a necessidade de ciclagem térmica (Notomi et al., 2000).

Clinical relevance

As técnicas de amplificação são amplamente utilizadas para detectar patógenos e caracterizar alvos genéticos em laboratórios de diagnóstico. Esta entrada descreve como a amplificação funciona e como seu desempenho é relatado; é uma referência metodológica e não fornece orientação para solicitar ou interpretar qualquer teste particular no cuidado ao paciente.

Evidence & guidelines

As diretrizes MIQE (Bustin et al., 2009) estabelecem as informações mínimas necessárias para relatar experimentos de PCR quantitativa em tempo real e são uma referência amplamente citada para transparência e reprodutibilidade. Estudos primários fundamentais descrevem o método original de PCR e a quantificação em tempo real (Saiki et al., 1985; Heid et al., 1996), enquanto trabalhos posteriores introduziram alternativas isotérmicas (Notomi et al., 2000).

History

A PCR foi concebida por Kary Mullis e aplicada pela primeira vez a um problema diagnóstico — a detecção da mutação da anemia falciforme — por Saiki e colegas em 1985, com o método formalmente descrito em 1986 (Saiki et al., 1985; Mullis et al., 1986). A introdução de polimerases termoestáveis automatizou o processo, e a detecção em tempo real na década de 1990 adicionou capacidade quantitativa (Heid et al., 1996). Técnicas isotérmicas posteriormente ampliaram a amplificação para ambientes sem termocicladores (Notomi et al., 2000).

Key figures

• Kary Mullis
• Randall Saiki
• Henry Erlich

Seminal works

• saiki-1985
• heid-1996
• bustin-2009

Frequently asked questions

Por que a PCR amplifica um alvo exponencialmente?

Cada ciclo copia cada fita existente do alvo, de modo que o número de cópias aproximadamente dobra a cada rodada; após muitos ciclos, uma sequência que começou como algumas moléculas pode atingir bilhões de cópias.

Como a amplificação isotérmica difere da PCR?

Métodos isotérmicos, como a amplificação isotérmica mediada por loop, amplificam o DNA a uma única temperatura constante usando primers e enzimas especializadas, eliminando a necessidade dos ciclos repetidos de aquecimento e resfriamento que a PCR convencional exige.