Aplicações da PCR em Tempo Real e PCR Quantitativa

A PCR em tempo real, também chamada de PCR quantitativa (qPCR), mede o acúmulo de DNA amplificado ciclo a ciclo por meio de um sinal fluorescente, permitindo estimar a quantidade inicial de uma sequência-alvo. Combinada com a transcrição reversa (RT-qPCR), é um dos métodos mais amplamente utilizados para quantificar a expressão gênica em patologia molecular.

Definition

A PCR quantitativa em tempo real é um método de amplificação de ácidos nucleicos que monitora a formação do produto em tempo real via fluorescência, utilizando o ciclo de quantificação para estimar a quantidade inicial de um alvo de DNA ou (após transcrição reversa) RNA.

Scope

Este tópico aborda o princípio de medição da PCR em tempo real, o ciclo de quantificação (Cq) e sua relação com a quantidade de molde, a quantificação relativa pelo método comparativo 2-DDCT, o papel dos genes de referência e da eficiência de amplificação, e os padrões de relato que governam a reprodutibilidade. Também menciona a PCR digital como uma abordagem relacionada de quantificação absoluta. Aborda estes como métodos laboratoriais, não como protocolos de testes clínicos.

Core questions

• Como o ciclo de quantificação se relaciona com a quantidade de molde inicial?
• Como a expressão relativa é calculada e normalizada na RT-qPCR?
• Por que a eficiência de amplificação e a escolha do gene de referência afetam o resultado?
• Como a PCR digital difere da PCR em tempo real na obtenção da quantificação?

Key concepts

• Ciclo de quantificação (Cq / Ct)
• Eficiência de amplificação
• Método comparativo 2-DDCT
• Genes de referência (housekeeping)
• qPCR com transcrição reversa
• PCR digital e particionamento
• Padrões de relato MIQE

Mechanisms

Durante a PCR, a sequência-alvo duplica a cada ciclo na fase exponencial, e um repórter fluorescente (um corante intercalante ou uma sonda sequência-específica) emite um sinal proporcional ao produto acumulado. O ciclo em que a fluorescência cruza um limiar definido (o ciclo de quantificação, Cq ou Ct) está inversamente relacionado ao log da quantidade inicial de molde, de modo que um Cq mais baixo significa mais alvo. A expressão relativa é mais comumente calculada com o método comparativo 2-DDCT, que normaliza o Cq do alvo para um gene de referência e para uma amostra calibradora, assumindo eficiências de amplificação quase iguais (Livak & Schmittgen, 2001). Como a eficiência, a estabilidade do gene de referência e a variabilidade da transcrição reversa afetam a estimativa, as diretrizes MIQE especificam os detalhes experimentais e a validação necessários para que um resultado seja interpretável (Bustin et al., 2009). A PCR digital, em vez disso, particiona a amostra em muitas reações e conta as partições positivas, fornecendo quantificação absoluta sem uma curva padrão (Huggett et al., 2013).

Clinical relevance

A RT-qPCR é uma plataforma rotineira para medir os níveis de transcritos subjacentes a resultados de diagnóstico e prognóstico molecular, e a compreensão de suas premissas faz parte da interpretação de relatórios laboratoriais. Esta entrada explica o método e suas limitações e não é uma base para pontos de corte diagnósticos ou manejo do paciente, que dependem de ensaios validados.

Evidence & guidelines

As expectativas de relato e qualidade para a PCR em tempo real são estabelecidas nas diretrizes MIQE (Bustin et al., 2009) e, para a PCR digital, nas diretrizes MIQE digitais (Huggett et al., 2013). O método comparativo 2-DDCT (Livak & Schmittgen, 2001) permanece a referência padrão para quantificação relativa.

History

A PCR em tempo real surgiu na década de 1990, quando a detecção fluorescente foi acoplada à ciclagem térmica, substituindo a quantificação de ponto final, que era trabalhosa. O método comparativo 2-DDCT (2001) padronizou a quantificação relativa, as diretrizes MIQE (2009) abordaram problemas generalizados de reprodutibilidade, e a PCR digital posteriormente expandiu o campo em direção à quantificação absoluta.

Debates

Como os genes de referência devem ser escolhidos para normalização?

A quantificação relativa assume expressão estável do gene de referência em todas as condições, mas genes housekeeping únicos podem variar; o uso de múltiplos genes de referência validados é recomendado para evitar normalização enviesada.

Key figures

• Stephen Bustin
• Kenneth Livak
• Thomas Schmittgen
• Jim Huggett

Seminal works

• livak-2001
• bustin-2009
• huggett-2013

Frequently asked questions

O que significa um valor de Ct mais baixo?

Um ciclo de quantificação (Ct ou Cq) mais baixo significa que a fluorescência cruza o limiar mais cedo, o que indica mais molde-alvo inicial; o Ct está inversamente relacionado ao log da quantidade inicial.

Como a PCR digital difere da qPCR em tempo real?

A PCR digital particiona a reação em muitos pequenos compartimentos e conta quantos contêm o alvo, fornecendo uma contagem absoluta sem uma curva padrão, enquanto a qPCR em tempo real infere a quantidade a partir do ciclo de quantificação, geralmente como uma medida relativa.