リアルタイムPCRと定量的PCRの応用

リアルタイムPCR（定量的PCR、qPCRとも呼ばれる）は、蛍光シグナルを介して増幅されたDNAの蓄積をサイクルごとに測定し、標的配列の開始量を推定することを可能にする。逆転写（RT-qPCR）と組み合わせることで、分子病理学における遺伝子発現を定量化するための最も広く用いられている方法の一つである。

Definition

リアルタイム定量的PCRは、蛍光を介してリアルタイムで産物形成を監視し、定量サイクルを用いてDNAまたは（逆転写後の）RNA標的の初期量を推定する核酸増幅法である。

Scope

このトピックでは、リアルタイムPCRの測定原理、定量サイクル（Cq）とその鋳型量との関係、比較2-DDCT法による相対定量、リファレンス遺伝子と増幅効率の役割、再現性を規定する報告基準について扱う。また、関連する絶対定量アプローチとしてデジタルPCRにも言及する。これらは臨床検査プロトコルではなく、実験室での方法として扱われる。

Core questions

• 定量サイクルは開始鋳型量とどのように関連していますか？
• RT-qPCRにおいて相対的発現はどのように計算され、正規化されますか？
• 増幅効率とリファレンス遺伝子の選択が結果に影響を与えるのはなぜですか？
• デジタルPCRはリアルタイムPCRとどのように異なり、定量化を達成しますか？

Key concepts

• 定量サイクル (Cq / Ct)
• 増幅効率
• 比較2-DDCT法
• リファレンス（ハウスキーピング）遺伝子
• 逆転写qPCR
• デジタルPCRと分割
• MIQE報告基準

Mechanisms

PCR中、指数関数的増幅期において標的配列はサイクルごとに倍増し、蛍光レポーター（インターカレート色素または配列特異的プローブ）が増幅産物の蓄積に比例したシグナルを発する。蛍光が定義された閾値を超えるサイクル（定量サイクル、CqまたはCt）は、開始鋳型量の対数に反比例するため、Cqが低いほど標的量が多いことを意味する。相対的発現は、最も一般的には比較2-DDCT法を用いて計算され、これは標的のCqをリファレンス遺伝子とキャリブレーターサンプルに対して正規化し、ほぼ等しい増幅効率を仮定する（Livak & Schmittgen, 2001）。効率、リファレンス遺伝子の安定性、逆転写の変動性がすべて推定値に影響を与えるため、MIQEガイドラインは結果が解釈可能であるために必要な実験の詳細とバリデーションを規定している（Bustin et al., 2009）。一方、デジタルPCRはサンプルを多数の反応に分割し、陽性区画を数えることで、標準曲線なしで絶対定量を行う（Huggett et al., 2013）。

Clinical relevance

RT-qPCRは、分子診断および予後診断の読み取りの背後にある転写産物レベルを測定するための日常的なプラットフォームであり、その前提を理解することは、検査報告書を解釈する上で重要である。この項目は、この方法とその限界を説明するものであり、検証されたアッセイに依存する診断カットオフや患者管理の根拠となるものではない。

Evidence & guidelines

リアルタイムPCRの報告および品質に関する期待値はMIQEガイドライン（Bustin et al., 2009）に、デジタルPCRについてはデジタルMIQEガイドライン（Huggett et al., 2013）に定められている。比較2-DDCT法（Livak & Schmittgen, 2001）は、相対定量の標準的なリファレンスとして依然として用いられている。

History

リアルタイムPCRは1990年代に、蛍光検出がサーマルサイクリングと結合され、労働集約的なエンドポイント定量に取って代わったことで登場した。比較2-DDCT法（2001年）は相対定量を標準化し、MIQEガイドライン（2009年）は広範な再現性の問題を解決し、その後デジタルPCRは絶対定量へと分野を拡大した。

Debates

正規化のためにリファレンス遺伝子をどのように選択すべきか？

相対定量は、条件間で安定したリファレンス遺伝子発現を仮定するが、単一のハウスキーピング遺伝子は変動する可能性がある。偏りのある正規化を避けるためには、検証された複数のリファレンス遺伝子を使用することが推奨される。

Key figures

• Stephen Bustin
• Kenneth Livak
• Thomas Schmittgen
• Jim Huggett

Seminal works

• livak-2001
• bustin-2009
• huggett-2013

Frequently asked questions

Ct値が低いとはどういう意味ですか？

定量サイクル（CtまたはCq）が低いということは、蛍光が閾値をより早く超えることを意味し、より多くの開始標的鋳型が存在することを示します。Ctは初期量の対数に反比例します。

デジタルPCRはリアルタイムqPCRとどのように異なりますか？

デジタルPCRは反応を多数の小さな区画に分割し、標的を含む区画の数を数えることで、標準曲線なしで絶対的なカウントを提供します。一方、リアルタイムqPCRは、定量サイクルから量を推測し、通常は相対的な尺度として用います。