分子診断：PCR、RT-PCR、および核酸増幅

分子診断は、ウイルスの核酸を増幅・同定することによりウイルスを検出します。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）および、RNAウイルスの場合には逆転写PCR（RT-PCR）は、標的ゲノム配列を数百万倍に複製するため、ごく微量のウイルスゲノムでも検出可能となり、これらの方法は高い感度と特異性を持つことから、現代のウイルス診断の主流となっています。

Definition

分子診断とは、PCR、RT-PCR、等温法などの増幅技術を用いて、ウイルス核酸を検出すること、および必要に応じて定量することであり、これらの技術は特定のゲノム標的を検出可能なレベルまで複製します。

Scope

このトピックでは、ウイルス学で用いられる核酸増幅技術、すなわち従来のPCRとリアルタイムPCR、RNAウイルス用の逆転写PCR、ウイルス量の定量的測定、およびループ媒介増幅などの等温代替法について扱います。参照レベルでの原理と解釈を説明し、アッセイプロトコルや臨床管理に関する助言は提供しません。

Core questions

• 標的配列を増幅することで、ごく微量のウイルスを検出可能にするにはどうすればよいですか？
• RNAウイルスはDNAウイルスと比較してどのような追加ステップが必要ですか？
• リアルタイムPCRはウイルス量を定量するためにどのように使用され、サイクル閾値は何を意味しますか？
• 従来のPCRと比較して、等温またはマルチプレックス形式が好ましいのはどのような場合ですか？

Key concepts

• ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）
• 逆転写（RT-PCR）
• プライマーと標的特異性
• サーマルサイクリングと指数関数的増幅
• リアルタイム（定量的）PCR
• サイクル閾値とウイルス量
• マルチプレックス増幅
• 等温増幅（例：LAMP）

Mechanisms

PCRは、ウイルスゲノムの選択された領域を挟む2つの短いプライマー、耐熱性DNAポリメラーゼ、および加熱と冷却の繰り返しサイクルを使用します。各サイクルでDNAは変性し、プライマーはアニーリングし、新しい鎖が伸長され、標的は倍増して指数関数的に蓄積します。RNAウイルスの場合、増幅の前に逆転写ステップでRNAゲノムを相補的DNAに変換します。リアルタイムPCRは、蛍光レポーターを用いてサイクルごとに産物の蓄積を監視し、定量化を可能にします。シグナルがバックグラウンドを超えるサイクル閾値は、初期テンプレート量と反比例関係にあり、ウイルス量の推定値を提供します。マルチプレックス設計では複数の標的を同時に増幅し、ループ媒介増幅などの等温法は一定温度で増幅を達成するため、分散型検査に必要な機器要件を低減します。

Clinical relevance

核酸増幅は、活動性ウイルス感染の感度と特異性の高い検出を提供し、感染の追跡や治療反応の評価に用いられるウイルス量モニタリングをサポートします。この項目では、これらの方法がどのように機能するか、およびサイクル閾値などの結果が原則としてどのように解釈されるかを説明します。これには、ゲノム検出自体が感染性ウイルスの存在を証明するものではないという点も含まれます。これは方法論の記述であり、個別の診断や治療の決定の根拠となるものではありません。

Epidemiology

リアルタイムRT-PCRはSARS-CoV-2感染確認の参照法となり、2020年初頭に検証済みアッセイが迅速に公開されたことで、分子検査の世界的な規模拡大が可能となりました。これは、核酸増幅がいかにアウトブレイクの検出と監視を支えているかを示しています。

History

ポリメラーゼ連鎖反応はKary Mullisによって考案され、1985年にSaikiらが遺伝子診断に初めて応用し、1987年にMullisとFaloonaによって方法が体系化されました。1996年にHeidらが記述したリアルタイム定量的PCRは連続的な定量化を加え、2000年にNotomiらが導入したループ媒介増幅などの等温法は、増幅が実施できる場所を広げました。

Key figures

• Kary Mullis
• Randall Saiki
• Christian Drosten

Seminal works

• saiki-1985
• mullis-faloona-1987
• heid-1996
• corman-2020

Frequently asked questions

PCRとRT-PCRの違いは何ですか？

PCRはDNAを増幅するため、DNAウイルスに直接使用されます。RT-PCRは、ウイルスのRNAゲノムをまず相補的DNAに変換する逆転写ステップを追加することで、インフルエンザやコロナウイルスなどのRNAウイルスを検出できるようにします。

PCR陽性結果は感染性ウイルスが存在することを意味しますか？

必ずしもそうではありません。PCRはウイルスゲノムを検出しますが、ウイルスが複製や感染性を失った後もゲノムが残存することがあります。感染性ウイルスの存在を確立するには、培養またはその他の機能アッセイを臨床的文脈で解釈する必要があります。