分子診断：PCRとシーケンス

分子的手法は、真菌をその増殖や外観ではなく、核酸によって検出・同定します。ポリメラーゼ連鎖反応は、検体または分離株から真菌DNAを増幅し、リボソーム遺伝子クラスターの内部転写スペーサーなどの保存領域のシーケンスは、増幅されたDNAを読み取り、培養よりも迅速かつ正確に生物を特定することがよくあります。

Definition

真菌の分子診断は、真菌の核酸を増幅および分析する技術であり、PCRを用いて真菌DNAを検出し、内部転写スペーサーなどの保存領域のDNAシーケンスを用いて属または種レベルで生物を同定します。

Scope

このトピックは、種特異的および広範囲（パン真菌）PCR、リアルタイムPCR、ITSなどのバーコード領域のDNAシーケンス、およびこれらの方法を培養分離株やホルマリン固定組織を含む臨床材料に直接使用することについて扱います。これらを同定および検出方法として位置づけ、検査や治療の指示は提供しません。

Core questions

• この検体中に真菌DNAは存在するか、またそれはどの生物由来か？
• 種特異的アッセイよりも広範囲パン真菌PCRが好ましいのはどのような場合か？
• 目的の真菌を最もよく識別するゲノム領域はどれか？
• 汚染や非生存DNA検出のリスクを考慮して、分子結果はどのように解釈されるべきか？

Key concepts

• ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）
• 種特異的PCRと広範囲（パン真菌）PCR
• リアルタイム（定量的）PCR
• 真菌バーコードとしての内部転写スペーサー（ITS）
• DNAシーケンスと参照データベース
• 分離株での検出と組織への直接検出
• 汚染管理と無細胞DNAの解釈

Mechanisms

PCRは、プライマーと耐熱性ポリメラーゼを用いて、繰り返されるサイクルによって標的DNAを増幅し、微量の真菌遺伝物質でも検出できる十分なコピーを生成します。種特異的アッセイは既知の生物を標的としますが、広範囲またはパン真菌アッセイは、多くの真菌に共通する保存領域に対するプライマーを使用し、その後のシーケンスによってその正体が明らかになります。リボソームRNA遺伝子クラスターの内部転写スペーサー領域は、Whiteらが記述した保存されたプライマーに挟まれており、種間で十分に多様であるため、普遍的な真菌バーコードとして機能し、読み取られたシーケンスは参照データベースと照合されて生物が特定されます。リアルタイムPCRは定量と速度を加え、アッセイは培養分離株またはホルマリン固定組織を含む臨床検体に直接実施できますが、DNAの分解や環境汚染が解釈を複雑にします。PCRは生存可能な細胞ではなくDNAを検出するため、結果は培養、顕微鏡検査、抗原所見と合わせて読み取られます。

Clinical relevance

分子検出とシーケンスは、真菌の同定方法や一部の感染症の認識方法をますます支えており、特定のPCR結果は、可能性のある侵襲性真菌症のコンセンサス分類に貢献しています。この項目は、参照資料としてこれらの方法とその解釈上の注意点を記述しており、検査や患者ケアを指示するものではありません。

Evidence & guidelines

EORTC/MSGERCのコンセンサス定義は、分子方法の成熟を反映して、可能性のある侵襲性真菌症の真菌学的基準の中に特定のPCR結果を組み込んでおり、最良実践の推奨事項は、培養および抗原検査と並んでその位置付けを記述しています。ITSシーケンスアプローチは、Whiteらが発表した広く使用されているプライマーに由来します。

History

1980年代にポリメラーゼ連鎖反応が開発された後、1990年にWhiteらが真菌リボソームRNA遺伝子を増幅および直接シーケンスするためのプライマーを発表したことで、真菌への応用が急速に進み、ITS領域が系統発生学的、そして後に診断マーカーとして確立されました。その後、リアルタイムPCR、広範囲パン真菌アッセイ、およびハイスループットシーケンスにより、分子真菌学は研究から日常的な同定および検出へと拡大しました。

Seminal works

• white-1990
• donnelly-2020

Frequently asked questions

ITS領域とは何か、なぜ真菌の同定に使用されるのか？

内部転写スペーサー（ITS）は、真菌のリボソーム遺伝子クラスターの一部であり、保存された配列に挟まれながらも種間で十分に多様であるため、シーケンスに基づく真菌同定のための実用的な普遍的バーコードとして機能します。

真菌PCR陽性は活動性感染を証明するか？

それだけでは証明しません。PCRは真菌DNAを検出しますが、これは生物がもはや生存可能でなくなった後も残存したり、汚染に由来したりする可能性があるため、分子結果は培養、顕微鏡検査、抗原検査と合わせて、また標準化された診断定義の範囲内で解釈されます。