定量的分子アッセイにおける品質保証

定量的分子アッセイにおける品質保証とは、発現測定を正確で再現性があり、異なる実験や研究室間で比較可能にするための基準、管理、および報告の実践システムです。これがなければ、qPCR、RNA-seq、または多遺伝子アッセイによる数値結果は信頼できず、比較もできません。

Definition

定量的分子アッセイにおける品質保証とは、遺伝子またはタンパク質の発現測定が分析的に妥当で再現性があることを確実にするために、標準化された手順、コントロール、参照物質、および透明性のある報告を協調的に使用することです。

Scope

このトピックは、定量的アッセイにおける前解析、解析、および後解析段階での変動源、参照物質とスパイクインコントロールの役割、MIQEなどの報告基準の機能、およびプラットフォームの再現性を確立したコンソーシアムによるベンチマーク研究を扱います。これは、実験室の操作手順や認定マニュアルとしてではなく、方法論および標準に関するトピックとして構成されています。

Core questions

• 前解析、解析、および後解析段階におけるエラーの原因は何ですか？
• 参照物質とコントロールは、定量的測定をどのように固定しますか？
• 透明性のある報告が再現性にとって重要なのはなぜですか？
• 測定プラットフォームの再現性はどのように実証されますか？

Key concepts

• 前解析、解析、および後解析段階
• 参照物質とキャリブレーター
• スパイクインおよびプロセス・コントロール
• 報告基準（例：MIQE）
• 施設間再現性
• 分析的妥当性

Mechanisms

定量的アッセイには、あらゆる段階で変動が生じます。サンプル採取とRNA完全性（前解析）、増幅効率、シーケンス深度、抗体性能、およびラン間のドリフト（解析）、ならびに正規化、閾値設定、および解釈（後解析）です。品質保証は、手順を固定し、陽性、陰性、およびプロセス・コントロールを含め、測定を参照物質とスパイクイン標準に固定してシグナルを較正することで、これらの変動に対処します。MIQEおよびデジタルMIQEガイドライン（Bustin et al., 2009; Huggett et al., 2013）で要求されるこれらの要素の透明性のある報告は、他者が結果を評価し再現することを可能にします。大規模な多施設共同研究は、マイクロアレイおよびRNA-seqプラットフォームで達成可能な再現性を示し、それを支える実践を定義しています（MAQC Consortium, 2006; SEQC/MAQC-III Consortium, 2014）。

Clinical relevance

信頼できる品質保証は、分子測定を診断および予後報告に利用することを可能にし、その構成要素を認識することは、結果の信頼性を評価するのに役立ちます。この項目は、方法論レベルでの品質原則と基準を記述するものであり、臨床検査プロトコル、認定要件、または患者管理の根拠を構成するものではありません。

Evidence & guidelines

定量的PCRおよびデジタルPCRの報告基準は、MIQEおよびデジタルMIQEガイドライン（Bustin et al., 2009; Huggett et al., 2013）によって定義されています。発現プラットフォームの再現性は、MicroArray Quality Controlプロジェクト（MAQC Consortium, 2006）およびRNA-seqのSequencing Quality Control研究（SEQC/MAQC-III Consortium, 2014）によって文書化されています。

History

2000年代に定量的分子アッセイが普及するにつれて、再現性のない結果に対する懸念から、協調的な標準化が促されました。MAQCプロジェクト（2006年）は研究室間のマイクロアレイの再現性をテストし、MIQEガイドライン（2009年）はqPCRの報告を標準化し、その後の取り組みはこれをデジタルPCR（2013年）およびRNA-seq（2014年）に拡大し、定量的発現解析における品質保証を専門分野として確立しました。

Debates

プラットフォーム間および研究室間で測定値はどの程度比較可能ですか？

コントロールを使用しても、絶対値はプラットフォームや施設間で異なる場合があるため、相対的な比較、共通の参照物質、および透明性のある報告に重点が置かれます。プラットフォーム間の結果をどの程度調和させられるかは、未解決の方法論的課題として残っています。

Key figures

• Stephen Bustin
• Jim Huggett
• Leming Shi

Seminal works

• bustin-2009
• maqc-2006
• seqc-2014

Frequently asked questions

分子アッセイにおける参照物質とコントロールの違いは何ですか？

参照物質は、測定を較正または固定するために使用される特性評価された標準であり、コントロールは、アッセイが期待通りに機能していることを確認するために試験サンプルと並行して実行されるサンプルです。どちらも品質保証に貢献しますが、異なる役割を果たします。

MIQEのような報告基準が重要なのはなぜですか？

基準は、定量的結果が他者によって評価され再現されるために開示されなければならない実験の詳細を規定します。これらがなければ、研究間の違いは、生物学的なものではなく、文書化されていない技術的な変動を反映している可能性があります。