PCRと核酸増幅法

核酸増幅法は、選択されたDNAまたはRNA配列を何倍にも複製することで、微量に存在する標的を検出および測定可能にする技術です。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）はその典型であり、変性、プライマーアニーリング、ポリメラーゼ伸長というサイクルを繰り返すことで、特定の配列を指数関数的に増加させ、分子診断の基礎となっています。

Definition

核酸増幅法は、特定のDNAまたはRNA配列の多くのコピーを酵素的に生成するin vitro法であり、PCRは温度サイクルとDNAポリメラーゼを使用して、2つのプライマーによって定義される領域を増幅します。

Scope

このトピックでは、従来の終点PCR、リアルタイム（定量的）PCR、RNA標的のための逆転写PCR、およびループ媒介等温増幅などの等温代替法について扱います。これは、アッセイプロトコルや臨床ガイドラインとしてではなく、方法論的な参照として増幅の原理、構成要素、および報告に関する考慮事項を扱います。

Key concepts

• 温度サイクル（変性、アニーリング、伸長）
• プライマーとDNAポリメラーゼ
• 指数関数的増幅
• RNA標的のための逆転写PCR
• リアルタイム（定量的）PCR
• 等温増幅（例：LAMP）
• コンタミネーション制御と偽陽性

Mechanisms

PCRでは、二本鎖DNAは熱変性によって一本鎖に分離され、短いオリゴヌクレオチドプライマーが標的を挟む配列にアニーリングし、耐熱性DNAポリメラーゼがプライマーを伸長して新しい相補鎖を合成します。このサイクルを繰り返すことで、各ラウンドで標的が2倍になり、指数関数的な増幅が得られます（Saiki et al., 1985; Mullis et al., 1986）。RNA標的は、増幅の前に逆転写酵素によって相補DNAに変換されます。リアルタイムPCRは、蛍光レポーターを使用してサイクルごとに産物蓄積を監視し、定量化を可能にします（Heid et al., 1996）。ループ媒介等温増幅などの等温法は、単一温度で増幅するため、温度サイクルの必要がありません（Notomi et al., 2000）。

Clinical relevance

増幅法は、診断検査室で病原体を検出したり、遺伝子標的を特徴付けたりするために広く使用されています。この項目では、増幅がどのように機能し、その性能がどのように報告されるかを説明しています。これは方法論的な参照であり、患者ケアにおける特定の検査のオーダーや解釈に関するガイダンスを提供するものではありません。

Evidence & guidelines

MIQEガイドライン（Bustin et al., 2009）は、定量的リアルタイムPCR実験を報告するために必要な最小限の情報を定めており、透明性と再現性のための広く引用される参照文献です。基礎的な一次研究では、元のPCR法とリアルタイム定量化について記述されており（Saiki et al., 1985; Heid et al., 1996）、その後の研究では等温代替法が導入されました（Notomi et al., 2000）。

History

PCRはKary Mullisによって考案され、1985年にSaikiらが鎌状赤血球変異の検出という診断問題に初めて適用し、この方法は1986年に正式に記述されました（Saiki et al., 1985; Mullis et al., 1986）。耐熱性ポリメラーゼの導入によりプロセスが自動化され、1990年代のリアルタイム検出により定量能力が追加されました（Heid et al., 1996）。その後、等温技術により、サーマルサイクラーのない環境でも増幅が可能になりました（Notomi et al., 2000）。

Key figures

• Kary Mullis
• Randall Saiki
• Henry Erlich

Seminal works

• saiki-1985
• heid-1996
• bustin-2009

Frequently asked questions

なぜPCRは標的を指数関数的に増幅するのですか？

各サイクルで標的の既存のすべての鎖が複製されるため、コピー数は各ラウンドでほぼ2倍になります。多くのサイクル後には、数分子から始まった配列が数十億のコピーに達することがあります。

等温増幅はPCRとどう異なりますか？

ループ媒介等温増幅などの等温法は、特殊なプライマーと酵素を使用して単一の一定温度でDNAを増幅するため、従来のPCRが必要とする繰り返しの加熱冷却サイクルが不要になります。