リアルタイム定量的解析とコピー数評価

定量的分子法は、標的核酸が検出可能であるかどうかだけでなく、その量を測定します。リアルタイム定量的PCRは増幅をリアルタイムで追跡し、デジタルPCRはサンプルを分割して分子を絶対的に数え、コピー数評価はゲノム領域の増減を決定します。

Definition

リアルタイム定量的解析は、標的核酸の量を測定するもので、通常は増幅中の蛍光シグナルをモニタリングするか（リアルタイムPCR）、陽性区画を数えることによって行われます（デジタルPCR）。コピー数評価は、ゲノム領域のコピー数を参照と比較して決定します。

Scope

このトピックは、リアルタイム（定量的）PCR、デジタルPCRおよびドロップレットデジタルPCR、ならびにコピー数評価へのアプローチを扱います。定量化の原理と、結果を比較可能にするための考慮事項について、臨床検査ガイドラインとしてではなく、方法論的な参考資料として提示します。

Key concepts

• リアルタイム（定量的）PCR
• 定量サイクル（Cq）と増幅効率
• 標準曲線と相対定量
• デジタルPCRとドロップレットデジタルPCR
• 分割による絶対定量
• コピー数の増減
• 報告基準と再現性

Mechanisms

リアルタイムPCRは、増幅と蛍光レポーターを結合させ、そのシグナルは生成物の蓄積に比例して上昇します。シグナルが閾値を超えるサイクルは、標的の初期量を反映し、相対的または標準曲線による定量化を可能にします（Heid et al., 1996）。一方、デジタルPCRは、サンプルを多数の微小な区画に分配し、各区画に0個または数個の分子が含まれるようにします。陽性区画の割合を数え、ポアソン統計を適用することで、標準曲線なしで絶対数を算出します（Hindson et al., 2011）。コピー数評価は、標的領域の存在量を参照と比較して増幅または欠失を検出するもので、比較ゲノムハイブリダイゼーションによって開拓された概念です（Kallioniemi et al., 1992）。

Clinical relevance

定量的およびコピー数評価法は、病原体量、遺伝子発現、ゲノムの増減を測定するために使用されます。この項目は、定量化がどのように機能するかを方法論的な参考資料として説明するものであり、患者ケアにおける特定の定量的アッセイの選択、解釈、またはそれに基づく行動について助言するものではありません。

Evidence & guidelines

定量的PCRの報告は、再現性のある出版に必要な最小限の情報を指定するMIQE勧告によってガイドされています（Bustin et al., 2009）。リアルタイム定量化（Heid et al., 1996）、絶対デジタル定量化（Hindson et al., 2011）、およびゲノムワイドなコピー数測定（Kallioniemi et al., 1992）に関する基礎的な一次研究が記述されています。

History

1990年代半ばのリアルタイムPCRは、増幅を定性的なツールから定量的なツールへと変え（Heid et al., 1996）、その10年後には合意された報告基準が続きました（Bustin et al., 2009）。その後、デジタルPCR、特にドロップレットデジタルPCRは、高精度での分子の絶対計数を可能にし（Hindson et al., 2011）、一方、コピー数評価は比較ゲノムハイブリダイゼーションからアレイベースおよびシーケンスベースの方法へと進化しました（Kallioniemi et al., 1992）。

Key figures

• Christian Heid
• Stephen Bustin
• Benjamin Hindson

Seminal works

• heid-1996
• hindson-2011
• bustin-2009

Frequently asked questions

デジタルPCRはリアルタイム定量的PCRとどのように異なりますか？

リアルタイムPCRは、蛍光シグナルが閾値を超える早さから標的の初期量を推定し、通常は標準と比較します。一方、デジタルPCRはサンプルを分割し、陽性区画を数えることで、標準曲線なしで絶対的な分子数を算出します。

コピー数評価は何を測定しますか？

特定のゲノム領域のコピー数を参照と比較して決定し、その領域の増幅（増加）または欠失（減少）を特定します。