Genotypisierungs- und Sequenzierungstechnologien

Genotypisierungs- und Sequenzierungstechnologien sind Labormethoden, die die genetische Variation nachweisen, die ein pharmakogenomischer Test meldet. Sie reichen von gezielten Assays, die eine feste Liste bekannter Varianten abfragen, bis zur Next-Generation-Sequenzierung, die DNA-Abschnitte Basenpaar für Basenpaar liest. Die Wahl der Plattform bestimmt, welche Varianten gefunden werden können, wie seltene oder strukturell komplexe Allele behandelt werden und somit, wie vollständig das Pharmakogenprofil eines Patienten charakterisiert werden kann.

Definition

Genotypisierungs- und Sequenzierungstechnologien sind die analytischen Methoden, die zum Nachweis ererbter DNA-Variationen in Pharmakogenen verwendet werden, umfassend gezielte Genotypisierungs-Assays, die auf vordefinierte Varianten testen, und Sequenzierungsmethoden, die die zugrunde liegende DNA-Sequenz lesen, um sowohl bekannte als auch neue Varianten zu identifizieren.

Scope

Dieser Eintrag behandelt die Hauptklassen der Nachweistechnologien, die in pharmakogenomischen Laboren verwendet werden: gezielte Einzelnukleotidvarianten-Genotypisierung (Arrays und allelspezifische Assays) und Sequenzierungsansätze einschließlich Sanger- und Next-Generation-Sequenzierung. Er erklärt, warum Genotypisierungspanels nur vordefinierte Varianten erkennen, während die Sequenzierung neue und komplexe Varianten entdecken kann, und warum komplexe Pharmakogene wie CYP2D6 jede Plattform herausfordern. Es handelt sich um eine Referenzbeschreibung von Methoden, nicht um ein Laborprotokoll oder eine Anleitung zur Testbestellung.

Core questions

• Was ist der Unterschied zwischen gezielter Genotypisierung und Sequenzierung, und was wird jeweils nachgewiesen?
• Warum melden Genotypisierungspanels nur eine begrenzte Anzahl von Varianten?
• Wie gehen Sequenzierungsplattformen mit neuen oder seltenen Pharmakogenvarianten um?
• Warum sind Gene wie CYP2D6 technisch schwierig genau zu typisieren?

Key concepts

• Gezielte Genotypisierung versus ungerichtete Sequenzierung
• Einzelnukleotidvarianten-Arrays
• Next-Generation-Sequenzierung
• Sanger-Sequenzierung
• Stern-Allel- und Diplotyp-Bestimmung
• Strukturelle Variation und Kopienzahl in Pharmakogenen
• Analytische Abdeckung und die von einem Panel übersehenen Varianten

Mechanisms

Gezielte Genotypisierungs-Assays testen eine DNA-Probe auf einen vorbestimmten Satz von Variantenpositionen, typischerweise häufige, gut charakterisierte Einzelnukleotidvarianten und ausgewählte strukturelle Veränderungen; sie sind schnell und kostengünstig, melden aber nur Varianten, für deren Nachweis sie konzipiert wurden. Die Sequenzierung liest stattdessen die Nukleotidsequenz von Zielregionen, sodass sie sowohl etablierte als auch bisher unbeobachtete Varianten identifizieren kann, einschließlich seltener Allele, die von gezielten Panels übersehen werden (Tafazoli et al., 2021; Roden, 2019). Nachgewiesene Varianten werden standardisierten Stern-Allel-Definitionen zugeordnet und zu einem Diplotyp kombiniert; das Pharmacogene Variation Consortium pflegt die Referenzallel-Definitionen, die diese Zuordnung über Labore hinweg konsistent machen (Gaedigk et al., 2017; Gaedigk et al., 2021). Hochpolymorphe und strukturell variable Gene wie CYP2D6, die Deletionen, Duplikationen und Hybridallele tragen können, bleiben für jede Plattform technisch anspruchsvoll.

Clinical relevance

Die von einem Labor verwendete Plattform prägt, was ein pharmakogenomisches Ergebnis aussagen kann: Ein normales gezieltes Genotypisierungsergebnis bedeutet lediglich, dass die getesteten Varianten nicht vorhanden waren, nicht aber, dass das Gen frei von jeglicher Variation ist. Das Erkennen dieses Unterschieds ist Teil der Bewertung eines pharmakogenomischen Berichts. Dieser Eintrag beschreibt, wie Variationen nachgewiesen werden, und ist keine Anleitung zur Auswahl, Bestellung oder Umsetzung eines spezifischen Tests.

Evidence & guidelines

Referenzallel-Definitionen, die zur Interpretation von Genotypisierungs- und Sequenzierungsergebnissen verwendet werden, werden vom Pharmacogene Variation Consortium kuratiert, das die Stern-Allel-Nomenklatur über Pharmakogene hinweg standardisiert (Gaedigk et al., 2017; Gaedigk et al., 2021). Übersichten zur Next-Generation-Sequenzierung in der klinischen Pharmakogenomik beschreiben die vergleichende Abdeckung und die Einschränkungen von Plattformen (Tafazoli et al., 2021). Dies sind methodische Referenzen und keine präskriptiven Versorgungsstandards.

History

Der pharmakogenomische Nachweis begann mit Einzelgen-Assays und der Sanger-Sequenzierung, expandierte dann mit Hochdurchsatz-Einzelnukleotidvarianten-Arrays, die es ermöglichten, viele Varianten gleichzeitig zu typisieren. Die Einführung der Next-Generation-Sequenzierung machte es praktikabel, ganze Pharmakogene zu lesen und seltene sowie neue Allele zu entdecken, wodurch sich das Feld von der Testung nur häufiger bekannter Varianten hin zu einer vollständigeren Charakterisierung verlagerte (Tafazoli et al., 2021; Roden, 2019). Parallel dazu gab die Konsolidierung der Allelnomenklatur unter dem Pharmacogene Variation Consortium dem Feld eine gemeinsame Referenz für die Benennung dessen, was diese Technologien nachweisen (Gaedigk et al., 2017).

Debates

Gezielte Genotypisierung versus Sequenzierung für klinische Tests

Gezielte Panels sind billiger und schneller, übersehen aber seltene und neue Varianten, während die Sequenzierung vollständiger, aber kostspieliger und komplexer in der Interpretation ist; das angemessene Gleichgewicht für routinemäßige pharmakogenomische Tests wird noch diskutiert.

Key figures

• Andrea Gaedigk
• Magnus Ingelman-Sundberg
• Teri E. Klein
• Dan M. Roden

Seminal works

• gaedigk-2017
• tafazoli-2021
• roden-2019

Frequently asked questions

Bedeutet ein normales Genotypisierungsergebnis, dass ein Patient keine relevanten Varianten aufweist?

Nicht unbedingt. Die gezielte Genotypisierung erkennt nur die spezifischen Varianten, für die sie entwickelt wurde, sodass ein normales Ergebnis diese Varianten ausschließt, aber seltene oder neue Varianten, die nur durch Sequenzierung gefunden würden, nicht ausschließen kann.

Warum gilt CYP2D6 als schwer zu genotypisieren?

CYP2D6 ist hochpolymorph und anfällig für strukturelle Veränderungen wie Gendeletionen, Duplikationen und Hybridallele, die auf vielen Plattformen technisch schwierig genau zu erkennen und aufzulösen sind.