PCR和核酸扩增

聚合酶链式反应——一种循环的、引物导向的方法，能够指数级地复制选定的DNA片段——以及在此基础上发展起来的更广泛的扩增技术家族。

Definition

聚合酶链式反应是一种体外方法，通过重复的链分离、侧翼引物退火以及耐热DNA聚合酶延伸的循环，指数级地扩增一个明确的DNA区域；核酸扩增更广泛地涵盖了复制DNA或RNA序列的相关技术。

Scope

本主题涵盖核酸扩增的原理和变体：定义聚合酶链式反应的变性、引物退火和延伸的热循环；引物和耐热聚合酶的作用；以及逆转录和定量实时扩增等扩展技术。它处理该方法及其逻辑；使用扩增DNA的测序和克隆在相关主题中介绍。

Core questions

• 重复的加热和冷却循环如何扩增特定的DNA区域？
• 为什么两个引物和耐热聚合酶是必不可少的？
• 扩增如何实现指数级增长？
• 该方法如何扩展以量化核酸或扩增RNA？

Key theories

引物定义的指数扩增

一对位于目标两侧的引物定义了扩增区域，并且由于每条新链在下一个循环中都作为模板，目标拷贝的数量每个循环大约翻倍，呈指数级增长。

耐热聚合酶实现循环

使用耐热DNA聚合酶可以在不重新添加酶的情况下进行重复高温变性，这使得自动化热循环变得实用且反应稳健。

Mechanisms

每个循环都会加热样品以分离DNA链，然后冷却样品，使两个引物退火到目标两侧的序列上，再加热到延伸温度，在此温度下，耐热聚合酶从引物合成新链。由于一个循环的产物作为下一个循环的模板，目标区域在多个循环中呈指数级扩增。变体包括逆转录扩增（首先将RNA复制成DNA）和实时定量扩增（监测产物积累以测量起始量）。

Clinical relevance

扩增是基因检测、病原体检测和法医鉴定的核心；此处以其重要性而非临床指导的形式呈现。

History

Mullis在20世纪80年代早期构思了聚合酶链式反应，Saiki及其同事在1985年的报告中展示了其应用，随后耐热聚合酶的采用使其成为常规技术；这项发明获得了1993年诺贝尔化学奖的认可。

Key figures

• Kary Mullis
• Randall Saiki
• Henry Erlich

Seminal works

• saiki1985
• lodish2016

Frequently asked questions

为什么PCR需要引物？

引物定义了每条链上合成的起始点，因此它们决定了复制哪个区域并使聚合酶能够开始延伸。

什么使扩增呈指数级增长？

每个循环的新链在下一个循环中成为模板，因此目标的拷贝数量每个循环大约翻倍。