重组DNA与分子克隆

限制酶、连接酶和载体如何用于切割和连接来自不同来源的DNA，并在宿主细胞中进行繁殖——这是基因工程的奠基技术。

Definition

重组DNA和分子克隆是将来自不同来源的DNA片段连接到载体中，并在宿主细胞中繁殖所得分子的一套方法，以便所选的DNA序列能够被扩增、维持和研究。

Scope

本主题涵盖重组DNA的构建及其克隆：限制酶和DNA在特定位点的切割，用DNA连接酶连接片段，质粒和其他载体的使用，导入宿主细胞，以及重组体的筛选。它阐述了克隆的原理；下游的扩增、测序和编辑在相关主题中介绍。

Core questions

• 限制酶如何切割特定序列的DNA？
• DNA片段如何连接到载体中？
• 什么是载体？它们如何将外源DNA带入宿主细胞？
• 如何筛选携带所需重组分子的细胞？

Key theories

序列特异性切割与连接

限制酶识别并切割特定的DNA序列，通常留下互补的末端，DNA连接酶可以将其连接起来，从而使来自不同来源的片段能够可预测地重组。

载体介导的繁殖

将片段插入复制型载体并导入宿主细胞，使重组DNA随宿主一同复制，从而产生大量所选序列的相同克隆。

Mechanisms

限制酶在特定的识别位点切割靶DNA和载体，通常会产生匹配的单链突出端。这些片段混合后由DNA连接酶连接形成重组分子，通过转化或相关方法导入宿主细胞。由于载体携带有复制起点和可选择标记，因此能够摄取并维持重组DNA的宿主细胞可以被识别和培养，从而产生大量克隆序列以供进一步使用。

Clinical relevance

分子克隆是胰岛素和抗体等重组蛋白生产以及基因治疗和疫苗载体构建的基础；此处作为其重要性而非临床指导提供。

History

20世纪70年代初，Arber、Smith和Nathans对限制酶的表征，以及Berg、Cohen和Boyer构建出第一个重组DNA分子，确立了分子克隆，并因此获得了诺贝尔奖的认可，使基因工程成为常规操作。

Key figures

• Hamilton Smith
• Daniel Nathans
• Werner Arber
• Paul Berg
• Herbert Boyer
• Stanley Cohen

Seminal works

• smith1970
• watson2013

Frequently asked questions

限制酶有什么作用？

它识别特定的短DNA序列并在那里切割DNA，通常会留下可以与被相同酶切割的其他片段连接的末端。

克隆中为什么需要载体？

载体将插入的DNA带入宿主细胞并在其中复制，因此克隆的序列得以复制，并可以被筛选和繁殖。