PCR和核酸扩增技术

核酸扩增技术将选定的DNA或RNA序列复制多倍，使微量存在的靶标变得可检测和可测量。聚合酶链反应（PCR）是其典型代表：通过重复的变性、引物退火和聚合酶延伸循环，它能使特定序列呈指数级增加，使其成为分子诊断的基石。

Definition

核酸扩增技术是体外方法，通过酶促作用生成特定DNA或RNA序列的多个拷贝，其中PCR利用热循环和DNA聚合酶扩增由两个引物界定的区域。

Scope

本主题涵盖了常规终点PCR、实时（定量）PCR、用于RNA靶标的逆转录PCR，以及等温扩增替代方法，如环介导等温扩增。它探讨了扩增的原理、组成和报告注意事项，作为方法学参考，而非检测方案或临床指南。

Key concepts

• 热循环（变性、退火、延伸）
• 引物和DNA聚合酶
• 指数扩增
• 用于RNA靶标的逆转录PCR
• 实时（定量）PCR
• 等温扩增（例如LAMP）
• 污染控制和假阳性

Mechanisms

在PCR中，双链DNA通过加热变性为单链，短寡核苷酸引物退火至靶标侧翼序列，热稳定DNA聚合酶延伸引物以合成新的互补链；重复该循环，每轮靶标数量翻倍，从而实现指数级扩增（Saiki et al., 1985; Mullis et al., 1986）。RNA靶标在扩增前首先通过逆转录酶转化为互补DNA。实时PCR通过荧光报告基因逐循环监测产物积累，从而实现定量（Heid et al., 1996）。环介导等温扩增等等温方法在单一温度下进行扩增，避免了热循环的需求（Notomi et al., 2000）。

Clinical relevance

扩增技术广泛用于诊断实验室中病原体的检测和遗传靶标的表征。本条目描述了扩增的工作原理及其性能报告方式；它是一个方法学参考，不提供患者护理中任何特定检测的开具或解释指南。

Evidence & guidelines

MIQE指南（Bustin et al., 2009）规定了报告定量实时PCR实验所需的最低信息，是透明度和可重复性方面广泛引用的参考文献。基础性原始研究描述了最初的PCR方法和实时定量（Saiki et al., 1985; Heid et al., 1996），而后续工作引入了等温替代方法（Notomi et al., 2000）。

History

PCR由Kary Mullis构思，并于1985年首次由Saiki及其同事应用于诊断问题——镰状细胞突变的检测，该方法于1986年正式描述（Saiki et al., 1985; Mullis et al., 1986）。热稳定聚合酶的引入使该过程自动化，1990年代的实时检测增加了定量能力（Heid et al., 1996）。等温技术随后将扩增范围扩展到没有热循环仪的环境（Notomi et al., 2000）。

Key figures

• Kary Mullis
• Randall Saiki
• Henry Erlich

Seminal works

• saiki-1985
• heid-1996
• bustin-2009

Frequently asked questions

为什么PCR能指数级扩增靶标？

每个循环都会复制靶标的每个现有链，因此拷贝数每轮大约翻倍；经过多个循环后，最初只有几个分子的序列可以达到数十亿个拷贝。

等温扩增与PCR有何不同？

环介导等温扩增等等温方法在单一恒定温度下使用特殊的引物和酶扩增DNA，从而无需常规PCR所需的重复加热和冷却循环。