DNA测序

DNA中碱基顺序的确定方法——从Sanger的链终止法到读取全基因组的大规模并行技术。

Definition

DNA测序是确定DNA分子中核苷酸精确顺序的过程，历史上通过链终止合成实现，现在主要通过同时读取多个片段的大规模并行方法实现。

Scope

本主题涵盖读取DNA核苷酸序列的方法：链终止（Sanger）法及其碱基特异性终止原理，以及随后出现并使基因组规模测序成为常规的高通量、大规模并行方法。它阐述了测序的逻辑；用于测序的DNA制备中的扩增和克隆在相关主题中介绍。

Core questions

• 链终止测序如何揭示碱基的顺序？
• 为什么标记的双脱氧核苷酸使测序变得实用？
• 大规模并行方法如何将测序扩展到整个基因组？
• 短读段如何组装成长序列和基因组？

Key theories

链终止测序

在链终止双脱氧核苷酸存在下进行合成，产生一系列在给定碱基的每个出现位置终止的片段，通过长度对这些片段进行排序即可揭示序列，这是Sanger及其同事引入的方法。

大规模并行测序

同时读取大量DNA片段并通过计算重建序列，极大地降低了成本并提高了通量，从而实现了常规的基因组规模测序。

Mechanisms

在链终止测序中，引物在模板上延伸，存在正常核苷酸和少量双脱氧核苷酸；双脱氧核苷酸一旦掺入，就会终止合成；结果是一系列末端碱基已知的嵌套片段，通过大小分离以读取序列。现代大规模并行平台固定并扩增许多模板片段，同时检测所有片段的碱基掺入，生成大量短读段，软件将其比对或组装成完整序列。

Clinical relevance

测序是基因诊断、癌症基因组学、病原体监测和个性化医疗方法的基础；此处旨在说明其重要性，而非提供临床指导。

History

Sanger的链终止法和并行的Maxam–Gilbert化学法均起源于20世纪70年代，使DNA测序成为可能并获得了诺贝尔奖认可；21世纪初大规模并行技术的兴起使成本降低了几个数量级，并开启了基因组时代。

Key figures

• Frederick Sanger
• Walter Gilbert

Seminal works

• sanger1977
• lodish2016

Frequently asked questions

什么是双脱氧核苷酸，为什么它用于测序？

它是一种修饰过的核苷酸，一旦添加，就会停止进一步的合成；将其随机掺入会生成在每个碱基处终止的片段，从而揭示序列。

现在如何如此快速地对整个基因组进行测序？

大规模并行平台可同时读取数百万个DNA片段，并使用软件进行组装，与早期方法相比，大大提高了速度并降低了成本。