分子诊断：PCR、RT-PCR和核酸扩增

分子诊断通过扩增和识别病毒核酸来检测病毒。聚合酶链反应（PCR）以及用于RNA病毒的逆转录PCR（RT-PCR）能将目标基因组序列复制数百万次，即使是极微量的病毒基因组也能被检测到，这使得这些方法具有高灵敏度和特异性，成为现代病毒诊断的主要手段。

Definition

分子诊断是通过PCR、RT-PCR和等温方法等扩增技术检测病毒核酸，并在需要时对其进行定量，这些技术能将特定的基因组靶点复制到可检测的水平。

Scope

本主题涵盖病毒学中使用的核酸扩增技术：常规PCR和实时PCR、用于RNA病毒的逆转录PCR、病毒载量的定量测量以及等温替代方法（如环介导扩增）。它以参考级别解释了原理和解读，不提供检测方案或临床管理建议。

Core questions

• 扩增目标序列如何使微量起始病毒变得可检测？
• 与DNA病毒相比，RNA病毒需要额外的哪些步骤？
• 实时PCR如何用于量化病毒载量，循环阈值意味着什么？
• 何时等温或多重格式优于常规PCR？

Key concepts

• 聚合酶链反应（PCR）
• 逆转录（RT-PCR）
• 引物和靶点特异性
• 热循环和指数扩增
• 实时（定量）PCR
• 循环阈值和病毒载量
• 多重扩增
• 等温扩增（例如LAMP）

Mechanisms

PCR使用两个短引物，它们位于病毒基因组选定区域的两侧，一个耐热DNA聚合酶，以及重复的加热和冷却循环。每个循环使DNA变性、引物退火并延伸新链，使靶点加倍，从而呈指数级累积。对于RNA病毒，逆转录步骤首先将RNA基因组转化为互补DNA，然后再进行扩增。实时PCR使用荧光报告基因逐循环监测产物累积，从而实现定量：信号高于背景的循环阈值与起始模板量呈反比关系，从而估算出病毒载量。多重设计可同时扩增多个靶点，而环介导扩增等等温方法可在恒定温度下实现扩增，从而降低了分散检测对仪器的要求。

Clinical relevance

核酸扩增为活动性病毒感染提供了灵敏和特异的检测，并支持用于跟踪感染和治疗反应的病毒载量监测。本条目描述了这些方法的工作原理以及如何原则上解读循环阈值等结果，包括基因组检测本身并不能证明存在感染性病毒；它描述的是方法学，而不是个体诊断或治疗决策的基础。

Epidemiology

实时RT-PCR成为确认SARS-CoV-2感染的参考方法，2020年初经过验证的检测方法迅速发布，使得分子检测在全球范围内得以推广，这说明了核酸扩增如何支撑疫情检测和监测。

History

聚合酶链反应由Kary Mullis构思，并于1985年由Saiki及其同事首次应用于基因诊断，该方法于1987年由Mullis和Faloona正式确立。由Heid及其同事于1996年描述的实时定量PCR增加了连续定量功能，而由Notomi及其同事于2000年引入的环介导扩增等等温方法拓宽了扩增的实施范围。

Key figures

• Kary Mullis
• Randall Saiki
• Christian Drosten

Seminal works

• saiki-1985
• mullis-faloona-1987
• heid-1996
• corman-2020

Frequently asked questions

PCR和RT-PCR有什么区别？

PCR扩增DNA，因此直接用于DNA病毒。RT-PCR增加了一个逆转录步骤，首先将病毒的RNA基因组转化为互补DNA，从而可以检测流感和冠状病毒等RNA病毒。

PCR阳性结果是否意味着存在感染性病毒？

不一定。PCR检测的是病毒基因组，病毒基因组在病毒不再复制或不具感染性后仍可能存在。确定感染性病毒的存在需要结合临床背景进行培养或其他功能性检测。