实时荧光定量PCR和定量PCR的应用

实时荧光定量PCR，也称为定量PCR（qPCR），通过荧光信号逐循环测量扩增DNA的积累，从而估算起始模板序列的量。结合逆转录（RT-qPCR），它是分子病理学中用于量化基因表达最广泛使用的方法之一。

Definition

实时荧光定量PCR是一种核酸扩增方法，通过荧光实时监测产物形成，并利用定量循环来估算DNA或（逆转录后）RNA靶标的初始量。

Scope

本主题涵盖实时荧光定量PCR的测量原理、定量循环（Cq）及其与模板量的关系、通过比较2-ΔΔCT方法进行的相对定量、内参基因和扩增效率的作用，以及规范可重复性的报告标准。它还提及数字PCR作为一种相关的绝对定量方法。本主题将这些方法作为实验室方法进行探讨，而非临床检测方案。

Core questions

• 定量循环与起始模板量之间有何关系？
• RT-qPCR中如何计算和标准化相对表达？
• 扩增效率和内参基因的选择为何会影响结果？
• 数字PCR在实现定量方面与实时荧光定量PCR有何不同？

Key concepts

• 定量循环（Cq / Ct）
• 扩增效率
• 比较2-ΔΔCT方法
• 内参（看家）基因
• 逆转录qPCR
• 数字PCR和分区
• MIQE报告标准

Mechanisms

在PCR过程中，靶序列在指数期每个循环都会倍增，荧光报告分子（嵌入染料或序列特异性探针）发出与累积产物成比例的信号。荧光信号超过预设阈值时的循环数（定量循环，Cq或Ct）与起始模板量的对数呈负相关，因此较低的Cq值意味着更多的靶标。相对表达最常用比较2-ΔΔCT方法计算，该方法将靶标的Cq值标准化至内参基因和校准样品，前提是扩增效率近似相等（Livak & Schmittgen, 2001）。由于效率、内参基因稳定性以及逆转录变异性都会影响估算结果，MIQE指南规定了解释结果所需的实验细节和验证（Bustin et al., 2009）。数字PCR则将样品分成许多反应，并计数阳性反应的份数，无需标准曲线即可实现绝对定量（Huggett et al., 2013）。

Clinical relevance

RT-qPCR是分子诊断和预后读数中测量转录水平的常规平台，理解其假设是解释实验室报告的一部分。本条目解释了该方法及其局限性，并非诊断截止值或患者管理的依据，这些取决于经过验证的检测方法。

Evidence & guidelines

实时荧光定量PCR的报告和质量要求在MIQE指南（Bustin et al., 2009）中规定，数字PCR则在数字MIQE指南（Huggett et al., 2013）中规定。比较2-ΔΔCT方法（Livak & Schmittgen, 2001）仍然是相对定量的标准参考。

History

实时荧光定量PCR在20世纪90年代出现，当时荧光检测与热循环技术相结合，取代了劳动密集型的终点定量方法。比较2-ΔΔCT方法（2001年）使相对定量标准化，MIQE指南（2009年）解决了普遍存在的重现性问题，数字PCR随后将该领域扩展到绝对定量。

Debates

如何选择内参基因进行标准化？

相对定量假设内参基因在不同条件下表达稳定，但单个看家基因可能存在变异；建议使用经过验证的多个内参基因，以避免偏倚的标准化。

Key figures

• Stephen Bustin
• Kenneth Livak
• Thomas Schmittgen
• Jim Huggett

Seminal works

• livak-2001
• bustin-2009
• huggett-2013

Frequently asked questions

较低的Ct值意味着什么？

较低的定量循环（Ct或Cq）意味着荧光更早地超过阈值，这表明起始靶模板量更多；Ct与初始量的对数呈负相关。

数字PCR与实时荧光定量PCR有何不同？

数字PCR将反应分成许多小隔室并计数有多少含有靶标，无需标准曲线即可提供绝对计数，而实时荧光定量PCR则通常通过定量循环推断量，作为相对测量。