RNA测序和转录组学

RNA测序（RNA-seq）通过高通量测序确定样本中RNA分子的种类和丰度，从而提供基因表达的定量、全基因组图景。转录组学是研究这种完整的转录本集合（即转录组）及其在不同组织、条件和疾病状态下如何变化的学科。

Definition

RNA测序是一种将RNA转化为测序片段文库，并计数映射到基因或转录本的读数，以量化细胞或组织中所有RNA分子（即转录组）表达的方法。

Scope

本主题涵盖RNA-seq如何将测序读数转化为表达估计值，转录组作为动态读数的意义，常见的定量单位，以及测序测量特有的质量和标准化问题。它将RNA-seq视为一种测量和发现平台，而非临床检测方案。

Core questions

• 测序读数如何转化为定量的表达估计值？
• 转录组除了固定的基因列表之外还捕获了什么？
• 标准化和读数深度如何影响可比性？
• 如何评估RNA-seq的准确性和可重复性？

Key concepts

• 转录组
• 读数比对和计数
• 标准化（例如深度和长度缩放）
• 差异表达
• 掺入对照
• 单细胞和批量转录组学

Mechanisms

提取RNA，逆转录为cDNA，片段化并制备成测序文库；将所得读数与参考基因组或转录组比对，每个特征重叠的读数数量提供与其表达成比例的计数（Mortazavi et al., 2008）。由于总读数深度和转录本长度会影响原始计数，因此在比较转录本之前需要对数据进行标准化，丰度通常以长度和深度缩放的单位表示。RNA-seq可以检测新的转录本、剪接变体和广泛的动态表达范围，这使其与早期的基于杂交的分析方法有所不同（Wang et al., 2009）。外部掺入标准品和联盟基准测试用于表征该平台的准确性和局限性（Jiang et al., 2011; SEQC/MAQC-III Consortium, 2014）。

Clinical relevance

RNA-seq日益成为分子肿瘤分析、融合检测和基于表达分类的基础，解释这些数据需要理解计数如何转化为表达估计值。本条目描述了该方法及其定量特性；它不提供诊断解释或治疗指导，这些依赖于经过验证的检测和临床标准。

Evidence & guidelines

RNA-seq作为一种定量方法的基础性描述（Mortazavi et al., 2008; Wang et al., 2009）得到了社区在准确性和可重复性方面努力的补充，包括外部掺入标准品（Jiang et al., 2011）和SEQC/MAQC-III对RNA-seq性能的基准测试（2014）。

History

转录组测量方法从表达序列标签和微阵列方法转向直接测序发生在2000年代后期，当时下一代测序使得全转录组读数计数变得实用（Mortazavi et al., 2008）。RNA-seq迅速成为表达研究的标准，随后的联盟工作解决了如何使其测量结果具有可比性和可重复性（SEQC/MAQC-III Consortium, 2014）。

Debates

RNA-seq计数应如何标准化以进行比较？

原始计数取决于测序深度和转录本长度，不同的标准化选择可能会改变哪些基因表现出差异表达；选择合适的标准化和对照仍然是一个方法学问题。

Key figures

• Zhong Wang
• Michael Snyder
• Ali Mortazavi
• Barbara Wold

Seminal works

• wang-2009
• mortazavi-2008
• seqc-2014

Frequently asked questions

什么是转录组？

转录组是细胞或组织在特定时间点存在的所有RNA转录本的完整集合；因为它随条件和细胞类型而变化，测量它可以显示哪些基因是活跃的以及活跃程度。

RNA-seq与微阵列在表达分析方面有何不同？

RNA-seq直接测序和计数RNA，因此它可以检测新的转录本和剪接变体，并覆盖广泛的动态范围，而微阵列测量与预定义探针的杂交，并且仅限于已知序列。