实时定量分析和拷贝数评估

定量分子方法衡量的是目标核酸的含量，而不仅仅是其是否可检测。实时定量PCR在扩增过程中跟踪扩增情况，数字PCR将样本分区以绝对计数分子，而拷贝数评估则确定基因组区域是获得还是丢失。

Definition

实时定量分析通过监测扩增过程中的荧光信号（实时PCR）或计数阳性分区（数字PCR）来测量目标核酸的量；拷贝数评估确定基因组区域相对于参考的拷贝数。

Scope

本主题涵盖实时（定量）PCR、数字和液滴数字PCR，以及拷贝数评估方法。它阐述了定量的原理和使结果具有可比性的考虑因素，作为方法学参考材料而非临床检测指南。

Key concepts

• 实时（定量）PCR
• 定量循环（Cq）和扩增效率
• 标准曲线和相对定量
• 数字和液滴数字PCR
• 通过分区进行绝对定量
• 拷贝数获得和丢失
• 报告标准和可重复性

Mechanisms

实时PCR将扩增与荧光报告基因偶联，其信号随产物积累而升高；信号跨越阈值的循环数反映了起始靶标量，从而实现相对或标准曲线定量（Heid et al., 1996）。数字PCR则将样本分配到许多微小分区中，使每个分区包含零个或几个分子；通过计数阳性分区的比例并应用泊松统计，无需标准曲线即可获得绝对计数（Hindson et al., 2011）。拷贝数评估将目标区域的丰度与参考进行比较，以检测扩增或缺失，这一思想由比较基因组杂交（Kallioniemi et al., 1992）开创。

Clinical relevance

定量和拷贝数方法用于测量病原体载量、基因表达以及基因组的获得或丢失。本条目解释了定量作为方法学参考的工作原理；它不就患者护理中任何特定定量检测的选择、解释或采取行动提供建议。

Evidence & guidelines

定量PCR的报告遵循MIQE建议，该建议规定了可重复发表所需的最低信息（Bustin et al., 2009）。基础性原始研究描述了实时定量（Heid et al., 1996）、绝对数字定量（Hindson et al., 2011）和全基因组拷贝数测量（Kallioniemi et al., 1992）。

History

20世纪90年代中期的实时PCR将扩增从定性工具转变为定量工具（Heid et al., 1996），十年后达成了共识报告标准（Bustin et al., 2009）。随后，数字PCR，特别是液滴数字PCR，实现了高精度的分子绝对计数（Hindson et al., 2011），而拷贝数评估则从比较基因组杂交发展到基于芯片和测序的方法（Kallioniemi et al., 1992）。

Key figures

• Christian Heid
• Stephen Bustin
• Benjamin Hindson

Seminal works

• heid-1996
• hindson-2011
• bustin-2009

Frequently asked questions

数字PCR与实时定量PCR有何不同？

实时PCR通过荧光信号何时跨越阈值来估计起始靶标量，通常是相对于标准品而言；而数字PCR则将样本分区并计数阳性隔室，从而无需标准曲线即可给出绝对分子计数。

拷贝数评估测量什么？

它确定特定基因组区域相对于参考存在的拷贝数，从而识别该区域的扩增（获得）或缺失（丢失）。