分子诊断：PCR和测序

分子方法通过检测和识别真菌的核酸，而非通过其生长或外观来鉴定真菌。聚合酶链反应（PCR）从样本或分离物中扩增真菌DNA，而对保守区域（特别是核糖体基因簇的内转录间隔区）进行测序，可以读取扩增的DNA以命名生物体，这通常比培养更快、更精确。

Definition

真菌分子诊断是扩增和分析真菌核酸的技术，利用PCR检测真菌DNA，并通过对内转录间隔区等保守区域进行DNA测序，将生物体鉴定到属或种的水平。

Scope

本主题涵盖了物种特异性和广谱（泛真菌）PCR、实时PCR、条形码区域（如ITS）的DNA测序，以及这些方法在培养分离物和直接在临床材料（包括福尔马林固定组织）上的应用。它将这些方法作为识别和检测方法进行阐述，不提供任何检测或治疗指导。

Core questions

• 该样本中是否存在真菌DNA，它来自哪种生物？
• 何时广谱泛真菌PCR优于物种特异性检测？
• 哪个基因组区域能最好地区分感兴趣的真菌？
• 考虑到污染和检测非活性DNA的风险，如何解释分子结果？

Key concepts

• 聚合酶链反应（PCR）
• 物种特异性与广谱（泛真菌）PCR
• 实时（定量）PCR
• 内转录间隔区（ITS）作为真菌条形码
• DNA测序和参考数据库
• 分离物检测与直接组织检测
• 污染控制和无细胞DNA的解释

Mechanisms

PCR利用引物和耐热聚合酶，通过重复循环扩增目标DNA，产生足够多的拷贝，即使是少量真菌遗传物质也能被检测到。物种特异性检测针对已知生物体，而广谱或泛真菌检测则使用针对许多真菌共享的保守区域的引物，随后通过测序揭示其身份。核糖体RNA基因簇的内转录间隔区（ITS），由White及其同事描述的保守引物所包围，在物种间具有足够的变异性，可作为通用的真菌条形码，读取的序列与参考数据库进行比对以命名生物体。实时PCR增加了定量和速度，检测可在培养分离物或直接在临床样本（包括福尔马林固定组织）上进行，尽管降解的DNA和环境污染会使解释复杂化。由于PCR检测的是DNA而非活细胞，因此结果需结合培养、显微镜检查和抗原检测结果进行判读。

Clinical relevance

分子检测和测序日益成为真菌鉴定和某些感染识别的基础，某些PCR结果有助于确定侵袭性真菌病的可能诊断共识类别。本条目旨在作为参考资料，描述这些方法及其解释上的注意事项，不指导检测或患者护理。

Evidence & guidelines

欧洲癌症研究与治疗组织/真菌感染研究教育小组（EORTC/MSGERC）的共识定义将特定的PCR结果纳入侵袭性真菌病可能诊断的真菌学标准中，这反映了分子方法的成熟；而最佳实践建议则阐述了它们在培养和抗原检测中的地位。ITS测序方法可追溯到White及其同事发表的广泛使用的引物。

History

20世纪80年代聚合酶链反应（PCR）发展之后，其在真菌学中的应用迅速发展。1990年，White及其同事发表了用于扩增和直接测序真菌核糖体RNA基因的引物，确立了ITS区域作为系统发育和后来的诊断标记。随后，实时PCR、广谱泛真菌检测和高通量测序将分子真菌学从研究领域扩展到常规鉴定和检测。

Seminal works

• white-1990
• donnelly-2020

Frequently asked questions

什么是ITS区域，为什么它被用于鉴定真菌？

内转录间隔区（ITS）是真菌核糖体基因簇的一部分，它在物种间具有足够的变异性，同时被保守序列所包围，使其成为基于测序的真菌鉴定的实用通用条形码。

阳性真菌PCR结果是否能证明活动性感染？

不能单独证明。PCR检测的是真菌DNA，它可能在生物体不再存活后仍然存在，或者来源于污染，因此分子结果需要结合培养、显微镜检查和抗原检测，并在标准化的诊断定义框架内进行解释。