Количественный анализ в реальном времени и оценка числа копий

Количественные молекулярные методы измеряют количество целевой нуклеиновой кислоты, а не просто определяют ее наличие. Количественная ПЦР в реальном времени отслеживает амплификацию по мере ее протекания, цифровая ПЦР разделяет образец для абсолютного подсчета молекул, а оценка числа копий определяет, произошло ли приобретение или потеря геномной области.

Definition

Количественный анализ в реальном времени измеряет количество целевой нуклеиновой кислоты, как правило, путем мониторинга флуоресцентного сигнала во время амплификации (ПЦР в реальном времени) или путем подсчета положительных разделений (цифровая ПЦР); оценка числа копий определяет количество копий геномной области относительно референсного значения.

Scope

Тема охватывает ПЦР в реальном времени (количественную), цифровую и капельную цифровую ПЦР, а также подходы к оценке числа копий. В ней рассматриваются принципы количественного определения и факторы, обеспечивающие сопоставимость результатов, представленные в качестве методологического справочного материала, а не руководства по клиническому тестированию.

Key concepts

• ПЦР в реальном времени (количественная)
• Цикл количественного определения (Cq) и эффективность амплификации
• Стандартные кривые и относительное количественное определение
• Цифровая и капельная цифровая ПЦР
• Абсолютное количественное определение путем разделения
• Приобретения и потери числа копий
• Стандарты отчетности и воспроизводимость

Mechanisms

ПЦР в реальном времени связывает амплификацию с флуоресцентным репортером, сигнал которого возрастает пропорционально накоплению продукта; цикл, в котором сигнал пересекает пороговое значение, отражает исходное количество мишени, что позволяет проводить относительное или количественное определение по стандартной кривой (Heid et al., 1996). Цифровая ПЦР вместо этого распределяет образец на множество крошечных разделений, так что каждое содержит ноль или несколько молекул; подсчет доли положительных разделений и применение статистики Пуассона дает абсолютное количество без стандартной кривой (Hindson et al., 2011). Оценка числа копий сравнивает количество целевой области с референсным значением для обнаружения амплификаций или делеций, идея, впервые предложенная сравнительной геномной гибридизацией (Kallioniemi et al., 1992).

Clinical relevance

Количественные методы и методы оценки числа копий используются для измерения вирусной нагрузки, экспрессии генов и геномных приобретений или потерь. Данная статья объясняет, как работает количественное определение, в качестве методологического справочника; она не дает советов по выбору, интерпретации или применению какого-либо конкретного количественного анализа в уходе за пациентами.

Evidence & guidelines

Отчетность по количественной ПЦР регулируется рекомендациями MIQE, которые определяют минимальную информацию, необходимую для воспроизводимой публикации (Bustin et al., 2009). Фундаментальные первичные исследования описывают количественное определение в реальном времени (Heid et al., 1996), абсолютное цифровое количественное определение (Hindson et al., 2011) и полногеномное измерение числа копий (Kallioniemi et al., 1992).

History

ПЦР в реальном времени в середине 1990-х годов превратила амплификацию из качественного в количественный инструмент (Heid et al., 1996), а согласованные стандарты отчетности появились десятилетие спустя (Bustin et al., 2009). Цифровая ПЦР, и особенно капельная цифровая ПЦР, затем позволила проводить абсолютный подсчет молекул с высокой точностью (Hindson et al., 2011), в то время как оценка числа копий развивалась от сравнительной геномной гибридизации к методам, основанным на массивах и секвенировании (Kallioniemi et al., 1992).

Key figures

• Christian Heid
• Stephen Bustin
• Benjamin Hindson

Seminal works

• heid-1996
• hindson-2011
• bustin-2009

Frequently asked questions

Чем цифровая ПЦР отличается от количественной ПЦР в реальном времени?

ПЦР в реальном времени оценивает исходное количество мишени по тому, насколько рано флуоресцентный сигнал пересекает пороговое значение, обычно относительно стандарта, тогда как цифровая ПЦР разделяет образец и подсчитывает положительные компартменты для получения абсолютного количества молекул без стандартной кривой.

Что измеряет оценка числа копий?

Она определяет, сколько копий определенной геномной области присутствует относительно референсного значения, выявляя амплификации (приобретения) или делеции (потери) этой области.