Обеспечение качества в количественных молекулярных анализах

Обеспечение качества в количественных молекулярных анализах — это система стандартов, средств контроля и методов отчетности, которые делают измерения экспрессии точными, воспроизводимыми и сопоставимыми между сериями экспериментов и лабораториями. Без этого числовой результат, полученный с помощью qPCR, RNA-seq или мультигенного анализа, не может считаться достоверным или сопоставимым.

Definition

Обеспечение качества в количественных молекулярных анализах — это скоординированное использование стандартизированных процедур, средств контроля, референсных материалов и прозрачной отчетности для обеспечения аналитической валидности и воспроизводимости измерений экспрессии генов или белков.

Scope

Эта тема охватывает преаналитические, аналитические и постаналитические источники вариаций в количественных анализах, роль референсных материалов и внутренних контролей (spike-in controls), функцию стандартов отчетности, таких как MIQE, а также исследования по бенчмаркингу консорциумов, которые установили воспроизводимость платформ. Она рассматривается как методологическая тема и тема стандартов, а не как лабораторная операционная процедура или руководство по аккредитации.

Core questions

• Каковы преаналитические, аналитические и постаналитические источники ошибок?
• Как референсные материалы и контроли привязывают количественное измерение?
• Почему прозрачная отчетность важна для воспроизводимости?
• Как демонстрируется воспроизводимость измерительной платформы?

Key concepts

• Преаналитические, аналитические и постаналитические фазы
• Референсные материалы и калибраторы
• Внутренние и процессуальные контроли
• Стандарты отчетности (например, MIQE)
• Межлабораторная воспроизводимость
• Аналитическая валидность

Mechanisms

Вариации проникают в количественный анализ на каждом этапе: сбор образцов и целостность РНК (преаналитический этап), эффективность амплификации, глубина секвенирования, характеристики антител и дрейф между сериями экспериментов (аналитический этап), а также нормализация, определение пороговых значений и интерпретация (постаналитический этап). Обеспечение качества противодействует этому путем фиксации процедур, включения положительных, отрицательных и процессуальных контролей, а также привязки измерений к референсным материалам и внутренним стандартам (spike-in standards) для калибровки сигнала. Прозрачная отчетность по этим элементам, как того требуют рекомендации MIQE и digital MIQE (Bustin et al., 2009; Huggett et al., 2013), позволяет другим оценивать и воспроизводить результаты. Крупные многолабораторные исследования демонстрируют достижимую воспроизводимость платформ микрочипов и RNA-seq и определяют практики, которые ее поддерживают (MAQC Consortium, 2006; SEQC/MAQC-III Consortium, 2014).

Clinical relevance

Надежное обеспечение качества позволяет использовать молекулярные измерения в диагностических и прогностических отчетах, а понимание его компонентов помогает в оценке достоверности результата. Эта статья описывает принципы и стандарты качества на методологическом уровне и не является протоколом клинической лаборатории, требованием аккредитации или основой для ведения пациентов.

Evidence & guidelines

Стандарты отчетности для количественной ПЦР и цифровой ПЦР определены рекомендациями MIQE и digital MIQE (Bustin et al., 2009; Huggett et al., 2013). Воспроизводимость экспрессионных платформ задокументирована проектом MicroArray Quality Control (MAQC Consortium, 2006) и исследованием Sequencing Quality Control для RNA-seq (SEQC/MAQC-III Consortium, 2014).

History

По мере распространения количественных молекулярных анализов в 2000-х годах обеспокоенность по поводу невоспроизводимых результатов привела к скоординированной стандартизации. Проект MAQC (2006) протестировал воспроизводимость микрочипов в разных лабораториях, рекомендации MIQE (2009) стандартизировали отчетность по qPCR, а последующие усилия распространили это на цифровую ПЦР (2013) и RNA-seq (2014), утвердив обеспечение качества как дисциплину в рамках количественного анализа экспрессии.

Debates

Насколько сопоставимы измерения между платформами и лабораториями?

Даже при наличии контролей абсолютные значения могут различаться между платформами и учреждениями, поэтому акцент делается на относительных сравнениях, общих референсных материалах и прозрачной отчетности; насколько результаты, полученные на разных платформах, могут быть гармонизированы, остается открытым методологическим вопросом.

Key figures

• Stephen Bustin
• Jim Huggett
• Leming Shi

Seminal works

• bustin-2009
• maqc-2006
• seqc-2014

Frequently asked questions

В чем разница между референсным материалом и контролем в молекулярном анализе?

Референсный материал — это охарактеризованный стандарт, используемый для калибровки или привязки измерения, в то время как контроль — это образец, запускаемый вместе с тестовыми образцами для подтверждения того, что анализ работает должным образом; оба вносят вклад в обеспечение качества, но выполняют разные роли.

Почему важны стандарты отчетности, такие как MIQE?

Стандарты определяют экспериментальные детали, которые должны быть раскрыты, чтобы количественный результат мог быть оценен и воспроизведен другими; без них различия между исследованиями могут отражать недокументированные технические вариации, а не биологию.