ПЦР и методы амплификации нуклеиновых кислот

Методы амплификации нуклеиновых кислот многократно копируют выбранную последовательность ДНК или РНК, так что целевой объект, присутствующий в следовых количествах, становится обнаруживаемым и измеряемым. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) является архетипом: посредством повторяющихся циклов денатурации, отжига праймеров и полимеразной элонгации она приводит к экспоненциальному увеличению определенной последовательности, что делает ее краеугольным камнем молекулярной диагностики.

Definition

Методы амплификации нуклеиновых кислот — это методы in vitro, которые ферментативно генерируют множество копий специфической последовательности ДНК или РНК, при этом ПЦР использует термоциклирование и ДНК-полимеразу для амплификации области, определяемой двумя праймерами.

Scope

Тема охватывает обычную конечную ПЦР, ПЦР в реальном времени (количественную), обратнотранскриптазную ПЦР для РНК-мишеней и изотермические альтернативы, такие как петлевая изотермическая амплификация. В ней рассматриваются принципы, компоненты и особенности отчетности амплификации как методологического справочника, а не как протоколов анализов или клинических рекомендаций.

Key concepts

• Термоциклирование (денатурация, отжиг, элонгация)
• Праймеры и ДНК-полимераза
• Экспоненциальная амплификация
• Обратнотранскриптазная ПЦР для РНК-мишеней
• ПЦР в реальном времени (количественная)
• Изотермическая амплификация (например, LAMP)
• Контроль контаминации и ложноположительные результаты

Mechanisms

В ПЦР двухцепочечная ДНК термически денатурируется в одноцепочечные, короткие олигонуклеотидные праймеры отжигают к последовательностям, фланкирующим мишень, и термостабильная ДНК-полимераза удлиняет праймеры для синтеза новых комплементарных цепей; повторение цикла удваивает мишень в каждом раунде, что приводит к экспоненциальной амплификации (Saiki et al., 1985; Mullis et al., 1986). РНК-мишени сначала превращаются в комплементарную ДНК с помощью обратной транскриптазы перед амплификацией. ПЦР в реальном времени отслеживает накопление продукта цикл за циклом с использованием флуоресцентных репортеров, что позволяет проводить количественную оценку (Heid et al., 1996). Изотермические методы, такие как петлевая изотермическая амплификация, амплифицируют при одной температуре, избегая необходимости термоциклирования (Notomi et al., 2000).

Clinical relevance

Методы амплификации широко используются для обнаружения патогенов и характеристики генетических мишеней в диагностических лабораториях. Эта статья описывает, как работает амплификация и как сообщаются ее результаты; это методологический справочник, который не содержит рекомендаций по назначению или интерпретации какого-либо конкретного теста в уходе за пациентами.

Evidence & guidelines

Руководство MIQE (Bustin et al., 2009) устанавливает минимальную информацию, необходимую для отчета об экспериментах по количественной ПЦР в реальном времени, и является широко цитируемым источником для обеспечения прозрачности и воспроизводимости. Фундаментальные первичные исследования описывают оригинальный метод ПЦР и количественную оценку в реальном времени (Saiki et al., 1985; Heid et al., 1996), в то время как более поздние работы представили изотермические альтернативы (Notomi et al., 2000).

History

ПЦР была задумана Кэри Муллисом и впервые применена для решения диагностической проблемы — обнаружения мутации серповидноклеточной анемии — Сайкой и коллегами в 1985 году, при этом метод был официально описан в 1986 году (Saiki et al., 1985; Mullis et al., 1986). Внедрение термостабильных полимераз автоматизировало процесс, а обнаружение в реальном времени в 1990-х годах добавило количественные возможности (Heid et al., 1996). Изотермические методы позже расширили применение амплификации в условиях без термоциклеров (Notomi et al., 2000).

Key figures

• Kary Mullis
• Randall Saiki
• Henry Erlich

Seminal works

• saiki-1985
• heid-1996
• bustin-2009

Frequently asked questions

Почему ПЦР амплифицирует мишень экспоненциально?

Каждый цикл копирует каждую существующую цепь мишени, поэтому количество копий примерно удваивается каждый раунд; после многих циклов последовательность, которая начиналась с нескольких молекул, может достичь миллиардов копий.

Чем изотермическая амплификация отличается от ПЦР?

Изотермические методы, такие как петлевая изотермическая амплификация, амплифицируют ДНК при одной постоянной температуре с использованием специализированных праймеров и ферментов, устраняя необходимость в повторяющихся циклах нагревания и охлаждения, которые требуются для обычной ПЦР.