Применение ПЦР в реальном времени и количественной ПЦР

ПЦР в реальном времени, также называемая количественной ПЦР (кПЦР), измеряет накопление амплифицированной ДНК цикл за циклом посредством флуоресцентного сигнала, что позволяет оценить исходное количество целевой последовательности. В сочетании с обратной транскрипцией (ОТ-кПЦР) это один из наиболее широко используемых методов для количественной оценки экспрессии генов в молекулярной патологии.

Definition

Количественная ПЦР в реальном времени — это метод амплификации нуклеиновых кислот, который отслеживает образование продукта в реальном времени с помощью флуоресценции, используя цикл количественной оценки для оценки исходного количества ДНК или (после обратной транскрипции) РНК-мишени.

Scope

Эта тема охватывает принцип измерения ПЦР в реальном времени, цикл количественной оценки (Cq) и его связь с количеством матрицы, относительную количественную оценку методом сравнительного 2-ΔΔCt, роль референсных генов и эффективность амплификации, а также стандарты отчетности, обеспечивающие воспроизводимость. Также отмечается цифровая ПЦР как связанный подход к абсолютной количественной оценке. Эти методы рассматриваются как лабораторные, а не как протоколы клинического тестирования.

Core questions

• Как цикл количественной оценки связан с количеством исходной матрицы?
• Как рассчитывается и нормализуется относительная экспрессия в ОТ-кПЦР?
• Почему эффективность амплификации и выбор референсного гена влияют на результат?
• Чем цифровая ПЦР отличается от ПЦР в реальном времени в достижении количественной оценки?

Key concepts

• Цикл количественной оценки (Cq / Ct)
• Эффективность амплификации
• Сравнительный метод 2-ΔΔCt
• Референсные (контрольные) гены
• ОТ-кПЦР (ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени)
• Цифровая ПЦР и разделение
• Стандарты отчетности MIQE

Mechanisms

Во время ПЦР целевая последовательность удваивается в каждом цикле в экспоненциальной фазе, а флуоресцентный репортер (интеркалирующий краситель или зонд, специфичный для последовательности) испускает сигнал, пропорциональный накопленному продукту. Цикл, в котором флуоресценция пересекает определенный порог (цикл количественной оценки, Cq или Ct), обратно пропорционален логарифму исходного количества матрицы, поэтому более низкий Cq означает большее количество мишени. Относительная экспрессия чаще всего рассчитывается с помощью сравнительного метода 2-ΔΔCt, который нормализует Cq мишени по референсному гену и калибровочному образцу, предполагая почти равную эффективность амплификации (Livak & Schmittgen, 2001). Поскольку эффективность, стабильность референсных генов и вариабельность обратной транскрипции влияют на оценку, рекомендации MIQE определяют экспериментальные детали и валидацию, необходимые для интерпретируемости результата (Bustin et al., 2009). Цифровая ПЦР вместо этого разделяет образец на множество реакций и подсчитывает положительные разделения, обеспечивая абсолютную количественную оценку без стандартной кривой (Huggett et al., 2013).

Clinical relevance

ОТ-кПЦР является рутинной платформой для измерения уровней транскриптов, лежащих в основе молекулярно-диагностических и прогностических показателей, и понимание ее допущений является частью интерпретации лабораторных отчетов. Эта статья объясняет метод и его ограничения и не является основой для диагностических пороговых значений или ведения пациентов, которые зависят от валидированных анализов.

Evidence & guidelines

Требования к отчетности и качеству для ПЦР в реальном времени изложены в рекомендациях MIQE (Bustin et al., 2009), а для цифровой ПЦР — в рекомендациях digital MIQE (Huggett et al., 2013). Сравнительный метод 2-ΔΔCt (Livak & Schmittgen, 2001) остается стандартным эталоном для относительной количественной оценки.

History

ПЦР в реальном времени появилась в 1990-х годах, когда флуоресцентное детектирование было объединено с термоциклированием, заменив трудоемкую конечную количественную оценку. Сравнительный метод 2-ΔΔCt (2001) стандартизировал относительную количественную оценку, рекомендации MIQE (2009) решили широко распространенные проблемы воспроизводимости, а цифровая ПЦР позже расширила область применения в сторону абсолютной количественной оценки.

Debates

Как следует выбирать референсные гены для нормализации?

Относительная количественная оценка предполагает стабильную экспрессию референсных генов в различных условиях, но экспрессия отдельных контрольных генов может варьироваться; для предотвращения смещенной нормализации рекомендуется использовать валидированные множественные референсные гены.

Key figures

• Stephen Bustin
• Kenneth Livak
• Thomas Schmittgen
• Jim Huggett

Seminal works

• livak-2001
• bustin-2009
• huggett-2013

Frequently asked questions

Что означает более низкое значение Ct?

Более низкий цикл количественной оценки (Ct или Cq) означает, что флуоресценция пересекает порог раньше, что указывает на большее количество исходной целевой матрицы; Ct обратно пропорционален логарифму исходного количества.

Чем цифровая ПЦР отличается от кПЦР в реальном времени?

Цифровая ПЦР разделяет реакцию на множество небольших отсеков и подсчитывает, сколько из них содержат мишень, давая абсолютное количество без стандартной кривой, тогда как кПЦР в реальном времени выводит количество из цикла количественной оценки, обычно как относительную меру.