DNAおよびRNAシーケンス法
シーケンス法は、DNA、または変換後のRNAにおけるヌクレオチドの正確な順序を決定します。サンガーの鎖停止化学反応から、超並列次世代プラットフォームに至るまで、これらの技術により、分子病理学は遺伝子を塩基ごとに読み取り、変異を検出し、遺伝子発現を大規模にプロファイリングすることが可能になりました。
Definition
DNAおよびRNAシーケンス法は、核酸分子中のヌクレオチド塩基の線形順序を読み取る実験室技術です。RNAは通常、シーケンスの前に相補的DNAに逆転写されます。
Scope
このトピックは、第一世代（サンガー）シーケンス、次世代（超並列）シーケンス、およびトランスクリプトーム解析のためのRNAシーケンスを対象とし、ライブラリ調製、シーケンス、リードのアライメントという一般的なワークフローとともに説明します。これは、臨床検査のガイダンスとしてではなく、方法論的な参考資料として提示されています。
Key concepts
- 鎖停止（サンガー）シーケンス
- 次世代／超並列シーケンス
- ライブラリ調製
- シーケンスリードとカバレッジ
- リードのアライメントとバリアントコール
- RNAシーケンス（トランスクリプトミクス）
- ターゲット、エクソーム、および全ゲノムシーケンス
Mechanisms
サンガーシーケンスは、鎖を終結させるジデオキシヌクレオチドを組み込むことで、あらゆる長さの断片を生成し、これらをサイズによって分離して配列を再構築します（Sanger et al., 1977）。一方、次世代シーケンスは、断片化されたDNAのライブラリを調製し、それを空間的に増幅し、数百万の断片を並行してシーケンスし、短い領域のシグナルを読み取って計算によって組み立てます（Margulies et al., 2005; Goodwin et al., 2016）。RNAシーケンスは、RNA由来の相補的DNAに同じ並列アプローチを適用し、転写産物を定量化し、スプライシングと発現パターンを明らかにします（Wang et al., 2009）。リードは、バリアントを特定したり、存在量を測定したりするためにリファレンスにアライメントされます。
Clinical relevance
シーケンスは、疾患関連バリアントの検出、および腫瘍や病原体の分子特性評価をサポートします。この項目は、これらの方法がどのようにシーケンスデータを生成するかを説明するものであり、参考資料として意図されています。個々の患者ケアにおけるシーケンス検査の選択、解釈、またはそれに基づく行動については助言するものではありません。
Evidence & guidelines
これらの方法は、サンガーの1977年の鎖停止法から、最初のハイスループットピコリットルプラットフォーム（Margulies et al., 2005）、ヒトゲノム配列（Venter et al., 2001）に至るまで、基礎となる一次文献に基づいています。その後、次世代技術の10年間とRNA-Seqの台頭を概観するレビューが発表されています（Goodwin et al., 2016; Wang et al., 2009）。
History
サンガーの鎖停止法（1977年）はDNAシーケンスを日常的なものにし、ヒトゲノムの最初のシーケンス（Venter et al., 2001）の基礎となりました。2000年代半ばに導入された超並列シーケンスは、コストを劇的に下げ、スループットを向上させ（Margulies et al., 2005）、10年以内に次世代シーケンスとRNA-Seqはゲノミクスとトランスクリプトミクスの標準的なツールとなりました（Goodwin et al., 2016; Wang et al., 2009）。
Key figures
- Frederick Sanger
- J. Craig Venter
- Marcel Margulies
Related topics
Seminal works
- sanger-1977
- margulies-2005
- goodwin-2016
Frequently asked questions
- 次世代シーケンスはサンガーシーケンスとどのように異なりますか？
- サンガーシーケンスは鎖停止化学反応を用いて一度に1つのDNA断片を読み取りますが、次世代シーケンスは超並列方式で数百万の断片を同時に読み取り、スループットを大幅に向上させ、塩基あたりのコストを削減します。
- RNAは直接シーケンスできますか？
- RNAは通常、まず逆転写によって相補的DNAに変換され、その後シーケンスされます。このRNA-Seqアプローチは、転写産物を定量化し、スプライシングと発現パターンを明らかにします。