DNAシーケンシング

DNAの塩基配列がどのように決定されるか — サンガーの鎖停止法から、ゲノム全体を読み取る超並列技術まで。

Definition

DNAシーケンシングとは、DNA分子中のヌクレオチドの正確な順序を決定することであり、歴史的には鎖停止合成によって達成され、現在では主に多数の断片を同時に読み取る超並列法によって行われています。

Scope

このトピックでは、DNAのヌクレオチド配列を読み取る方法について扱います。具体的には、鎖停止（サンガー）法とその塩基特異的停止の原理、およびそれに続くハイスループットな超並列アプローチで、ゲノム規模のシーケンシングを日常的なものにした技術です。シーケンシングの論理について説明し、シーケンシングのためのDNAの準備である増幅とクローニングは関連トピックで扱います。

Core questions

• 鎖停止シーケンシングはどのようにして塩基の順序を明らかにするのでしょうか？
• 標識されたジデオキシヌクレオチドがシーケンシングを実用的にしたのはなぜでしょうか？
• 超並列法はどのようにしてシーケンシングを全ゲノム規模に拡大したのでしょうか？
• 短いリードはどのようにしてより長い配列やゲノムに組み立てられるのでしょうか？

Key theories

鎖停止シーケンシング

サンガーらが導入した鎖停止ジデオキシヌクレオチドの存在下での合成により、特定の塩基の各出現箇所で終わる断片のセットが生成され、これらを長さ順に並べることで配列が明らかになります。

超並列シーケンシング

膨大な数のDNA断片を一度に読み取り、計算によって配列を再構築することで、コストが削減され、スループットが劇的に向上し、ゲノム規模のシーケンシングが日常的に行われるようになりました。

Mechanisms

鎖停止シーケンシングでは、通常のヌクレオチドと少量のジデオキシヌクレオチドの存在下で、プライマーが鋳型に沿って伸長されます。ジデオキシヌクレオチドが組み込まれると合成が停止するため、末端塩基が既知であるネストされた断片のセットが生成され、これらをサイズで分離することで配列が読み取られます。現代の超並列プラットフォームでは、多数の鋳型断片を固定化して増幅し、それらすべてにわたる塩基の組み込みを同時に検出することで、多数の短いリードを生成します。これらのリードはソフトウェアによってアラインメントまたはアセンブルされ、完全な配列が構築されます。

Clinical relevance

シーケンシングは、遺伝子診断、がんゲノミクス、病原体サーベイランス、個別化医療の基盤となります。これはその重要性を示すものであり、臨床的ガイダンスではありません。

History

サンガーの鎖停止法と、並行して開発されたマキサム・ギルバート化学法は、いずれも1970年代にDNAシーケンシングを可能にし、ノーベル賞の評価を得ました。2000年代に超並列技術が登場したことで、コストが桁違いに削減され、ゲノム時代が到来しました。

Key figures

• Frederick Sanger
• Walter Gilbert

Seminal works

• sanger1977
• lodish2016

Frequently asked questions

ジデオキシヌクレオチドとは何ですか、またなぜシーケンシングに使用されるのですか？

それは、一度組み込まれるとそれ以上の合成を停止させる修飾ヌクレオチドです。これをランダムな位置に組み込むことで、各塩基で終わる断片が生成され、配列が明らかになります。

現在、全ゲノムをこれほど迅速にシーケンシングできるのはなぜですか？

超並列プラットフォームは、一度に数百万のDNA断片を読み取り、ソフトウェアを使用してそれらを組み立てるため、以前の方法と比較して速度が大幅に向上し、コストが削減されました。