रियल-टाइम पीसीआर और क्वांटिटेटिव पीसीआर अनुप्रयोग

रियल-टाइम पीसीआर, जिसे क्वांटिटेटिव पीसीआर (qPCR) भी कहा जाता है, एक फ्लोरोसेंट सिग्नल के माध्यम से प्रवर्धित डीएनए के संचय को चक्र-दर-चक्र मापता है, जिससे लक्ष्य अनुक्रम की प्रारंभिक मात्रा का अनुमान लगाया जा सकता है। रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन (RT-qPCR) के साथ संयुक्त होने पर, यह आणविक विकृति विज्ञान में जीन अभिव्यक्ति को मापने के लिए सबसे व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली विधियों में से एक है।

Definition

रियल-टाइम क्वांटिटेटिव पीसीआर एक न्यूक्लिक-एसिड प्रवर्धन विधि है जो फ्लोरेसेंस के माध्यम से वास्तविक समय में उत्पाद निर्माण की निगरानी करती है, डीएनए या (रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के बाद) आरएनए लक्ष्य की प्रारंभिक मात्रा का अनुमान लगाने के लिए क्वांटिफिकेशन चक्र का उपयोग करती है।

Scope

यह विषय रियल-टाइम पीसीआर के मापन सिद्धांत, क्वांटिफिकेशन चक्र (Cq) और टेम्पलेट मात्रा के साथ इसके संबंध, तुलनात्मक 2-DDCT विधि द्वारा सापेक्ष क्वांटिफिकेशन, संदर्भ जीनों की भूमिका और प्रवर्धन दक्षता, और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्यता को नियंत्रित करने वाले रिपोर्टिंग मानकों को शामिल करता है। यह डिजिटल पीसीआर को एक संबंधित निरपेक्ष-क्वांटिफिकेशन दृष्टिकोण के रूप में भी नोट करता है। यह इन्हें प्रयोगशाला विधियों के रूप में संबोधित करता है, न कि नैदानिक परीक्षण प्रोटोकॉल के रूप में।

Core questions

• क्वांटिफिकेशन चक्र प्रारंभिक टेम्पलेट की मात्रा से कैसे संबंधित है?
• RT-qPCR में सापेक्ष अभिव्यक्ति की गणना और सामान्यीकरण कैसे किया जाता है?
• प्रवर्धन दक्षता और संदर्भ-जीन का चुनाव परिणाम को क्यों प्रभावित करता है?
• क्वांटिफिकेशन प्राप्त करने में डिजिटल पीसीआर रियल-टाइम पीसीआर से कैसे भिन्न है?

Key concepts

• क्वांटिफिकेशन चक्र (Cq / Ct)
• प्रवर्धन दक्षता
• तुलनात्मक 2-DDCT विधि
• संदर्भ (हाउसकीपिंग) जीन
• रिवर्स-ट्रांसक्रिप्शन qPCR
• डिजिटल पीसीआर और विभाजन
• MIQE रिपोर्टिंग मानक

Mechanisms

पीसीआर के दौरान लक्ष्य अनुक्रम घातीय चरण में प्रत्येक चक्र में दोगुना हो जाता है, और एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर (एक इंटरकैलटिंग डाई या एक अनुक्रम-विशिष्ट जांच) संचित उत्पाद के अनुपात में एक संकेत उत्सर्जित करता है। वह चक्र जिस पर फ्लोरेसेंस एक परिभाषित सीमा (क्वांटिफिकेशन चक्र, Cq या Ct) को पार करता है, प्रारंभिक टेम्पलेट मात्रा के लॉग के व्युत्क्रमानुपाती होता है, इसलिए कम Cq का अर्थ अधिक लक्ष्य होता है। सापेक्ष अभिव्यक्ति की गणना आमतौर पर तुलनात्मक 2-DDCT विधि से की जाती है, जो लक्ष्य के Cq को एक संदर्भ जीन और एक कैलिब्रेटर नमूने के लिए सामान्य करती है, जिसमें लगभग समान प्रवर्धन दक्षता (लिवक और श्मिटजेन, 2001) मानी जाती है। क्योंकि दक्षता, संदर्भ-जीन स्थिरता, और रिवर्स-ट्रांसक्रिप्शन परिवर्तनशीलता सभी अनुमान को प्रभावित करते हैं, MIQE दिशानिर्देश एक परिणाम के व्याख्या योग्य होने के लिए आवश्यक प्रायोगिक विवरण और सत्यापन निर्दिष्ट करते हैं (बस्टिन एट अल।, 2009)। डिजिटल पीसीआर इसके बजाय नमूने को कई प्रतिक्रियाओं में विभाजित करता है और सकारात्मक विभाजनों की गणना करता है, जो एक मानक वक्र के बिना निरपेक्ष क्वांटिफिकेशन देता है (हगेट एट अल।, 2013)।

Clinical relevance

RT-qPCR आणविक नैदानिक और रोगनिरोधी रीडआउट के पीछे प्रतिलेख स्तरों को मापने के लिए एक नियमित मंच है, और इसकी मान्यताओं को समझना प्रयोगशाला रिपोर्टों की व्याख्या का हिस्सा है। यह प्रविष्टि विधि और इसकी सीमाओं की व्याख्या करती है और नैदानिक कट-ऑफ या रोगी प्रबंधन का आधार नहीं है, जो मान्य परख पर निर्भर करते हैं।

Evidence & guidelines

रियल-टाइम पीसीआर के लिए रिपोर्टिंग और गुणवत्ता की अपेक्षाएं MIQE दिशानिर्देशों (बस्टिन एट अल।, 2009) और, डिजिटल पीसीआर के लिए, डिजिटल MIQE दिशानिर्देशों (हगेट एट अल।, 2013) में निर्धारित की गई हैं। तुलनात्मक 2-DDCT विधि (लिवक और श्मिटजेन, 2001) सापेक्ष क्वांटिफिकेशन के लिए मानक संदर्भ बनी हुई है।

History

रियल-टाइम पीसीआर 1990 के दशक में उभरा जब फ्लोरोसेंट डिटेक्शन को थर्मल साइक्लिंग के साथ जोड़ा गया, जिससे श्रम-गहन एंडपॉइंट क्वांटिफिकेशन की जगह ले ली गई। तुलनात्मक 2-DDCT विधि (2001) ने सापेक्ष क्वांटिफिकेशन को मानकीकृत किया, MIQE दिशानिर्देशों (2009) ने व्यापक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्यता समस्याओं को संबोधित किया, और डिजिटल पीसीआर ने बाद में निरपेक्ष क्वांटिफिकेशन की दिशा में क्षेत्र का विस्तार किया।

Debates

सामान्यीकरण के लिए संदर्भ जीनों का चुनाव कैसे किया जाना चाहिए?

सापेक्ष क्वांटिफिकेशन स्थितियों में स्थिर संदर्भ-जीन अभिव्यक्ति को मानता है, लेकिन एकल हाउसकीपिंग जीन भिन्न हो सकते हैं; पक्षपाती सामान्यीकरण से बचने के लिए मान्य एकाधिक संदर्भ जीनों का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।

Key figures

• Stephen Bustin
• Kenneth Livak
• Thomas Schmittgen
• Jim Huggett

Seminal works

• livak-2001
• bustin-2009
• huggett-2013

Frequently asked questions

कम Ct मान का क्या अर्थ है?

कम क्वांटिफिकेशन चक्र (Ct या Cq) का अर्थ है कि फ्लोरेसेंस सीमा को पहले पार करता है, जो अधिक प्रारंभिक लक्ष्य टेम्पलेट को इंगित करता है; Ct प्रारंभिक मात्रा के लॉग के व्युत्क्रमानुपाती होता है।

डिजिटल पीसीआर रियल-टाइम qPCR से कैसे भिन्न है?

डिजिटल पीसीआर प्रतिक्रिया को कई छोटे डिब्बों में विभाजित करता है और गिनता है कि कितने में लक्ष्य होता है, एक मानक वक्र के बिना एक निरपेक्ष गणना देता है, जबकि रियल-टाइम qPCR क्वांटिफिकेशन चक्र से मात्रा का अनुमान लगाता है, आमतौर पर एक सापेक्ष माप के रूप में।