आणविक निदान: पीसीआर, आरटी-पीसीआर, और न्यूक्लिक एसिड प्रवर्धन

आणविक निदान एक वायरस का पता उसके न्यूक्लिक एसिड को प्रवर्धित और पहचान कर लगाता है। पॉलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) और, आरएनए वायरस के लिए, रिवर्स-ट्रांसक्रिप्शन पीसीआर (आरटी-पीसीआर) एक लक्ष्य जीनोम अनुक्रम को लाखों गुना कॉपी करते हैं ताकि वायरल जीनोम की बहुत कम मात्रा भी पता लगाने योग्य हो जाए, जिससे इन तरीकों को उच्च संवेदनशीलता और विशिष्टता मिलती है और वे आधुनिक वायरल निदान का मुख्य आधार बन जाते हैं।

Definition

आणविक निदान पीसीआर, आरटी-पीसीआर, और समतापी विधियों जैसी प्रवर्धन तकनीकों द्वारा वायरल न्यूक्लिक एसिड का पता लगाना और, जहाँ आवश्यक हो, उसका परिमाणीकरण है, जो एक विशिष्ट जीनोम लक्ष्य को पता लगाने योग्य स्तरों तक कॉपी करते हैं।

Scope

यह विषय वायरोलॉजी में उपयोग की जाने वाली न्यूक्लिक-एसिड प्रवर्धन तकनीकों को शामिल करता है: पारंपरिक और वास्तविक समय पीसीआर, आरएनए वायरस के लिए रिवर्स-ट्रांसक्रिप्शन पीसीआर, वायरल लोड का मात्रात्मक माप, और लूप-मध्यस्थ प्रवर्धन जैसे समतापी विकल्प। यह संदर्भ स्तर पर सिद्धांतों और व्याख्या की व्याख्या करता है और परख प्रोटोकॉल या नैदानिक ​​प्रबंधन सलाह प्रदान नहीं करता है।

Core questions

• एक लक्ष्य अनुक्रम को प्रवर्धित करने से एक छोटे प्रारंभिक मात्रा से वायरस का पता कैसे लगाया जा सकता है?
• डीएनए वायरस की तुलना में आरएनए वायरस को किस अतिरिक्त चरण की आवश्यकता होती है?
• वास्तविक समय पीसीआर का उपयोग वायरल लोड को मापने के लिए कैसे किया जाता है, और चक्र सीमा का क्या अर्थ है?
• पारंपरिक पीसीआर की तुलना में समतापी या मल्टीप्लेक्स प्रारूप कब बेहतर होते हैं?

Key concepts

• पॉलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर)
• रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन (आरटी-पीसीआर)
• प्राइमर और लक्ष्य विशिष्टता
• थर्मल साइक्लिंग और घातीय प्रवर्धन
• वास्तविक समय (मात्रात्मक) पीसीआर
• चक्र सीमा और वायरल लोड
• मल्टीप्लेक्स प्रवर्धन
• समतापी प्रवर्धन (जैसे, LAMP)

Mechanisms

पीसीआर वायरल जीनोम के एक चुने हुए क्षेत्र को घेरने वाले दो छोटे प्राइमर, एक थर्मोस्टेबल डीएनए पॉलीमरेज़, और हीटिंग और कूलिंग के दोहराए गए चक्रों का उपयोग करता है। प्रत्येक चक्र डीएनए को विकृत करता है, प्राइमर को जोड़ता है, और नए स्ट्रैंड्स का विस्तार करता है, लक्ष्य को दोगुना करता है ताकि यह तेजी से जमा हो। आरएनए वायरस के लिए, एक रिवर्स-ट्रांसक्रिप्शन चरण पहले आरएनए जीनोम को प्रवर्धन से पहले पूरक डीएनए में परिवर्तित करता है। वास्तविक समय पीसीआर फ्लोरोसेंट रिपोर्टर का उपयोग करके चक्र दर चक्र उत्पाद संचय की निगरानी करता है, जिससे परिमाणीकरण की अनुमति मिलती है: चक्र सीमा जिस पर संकेत पृष्ठभूमि से ऊपर उठता है, प्रारंभिक टेम्पलेट की मात्रा के विपरीत संबंधित होता है, जिससे वायरल लोड का अनुमान मिलता है। मल्टीप्लेक्स डिज़ाइन एक साथ कई लक्ष्यों को प्रवर्धित करते हैं, और लूप-मध्यस्थ प्रवर्धन जैसी समतापी विधियाँ एक स्थिर तापमान पर प्रवर्धन प्राप्त करती हैं, जिससे विकेन्द्रीकृत परीक्षण के लिए उपकरण आवश्यकताओं को कम किया जा सकता है।

Clinical relevance

न्यूक्लिक-एसिड प्रवर्धन सक्रिय वायरल संक्रमण का संवेदनशील और विशिष्ट पता लगाने में मदद करता है और वायरल-लोड निगरानी का समर्थन करता है जिसका उपयोग संक्रमणों और उपचार प्रतिक्रिया का पालन करने के लिए किया जाता है। यह प्रविष्टि बताती है कि विधियाँ कैसे काम करती हैं और चक्र सीमा जैसे परिणामों की सैद्धांतिक रूप से व्याख्या कैसे की जाती है, जिसमें यह बिंदु भी शामिल है कि जीनोम का पता लगाना अपने आप में संक्रामक वायरस की उपस्थिति को साबित नहीं करता है; यह कार्यप्रणाली का वर्णनात्मक है और व्यक्तिगत नैदानिक ​​या उपचार निर्णयों का आधार नहीं है।

Epidemiology

वास्तविक समय आरटी-पीसीआर SARS-CoV-2 संक्रमण की पुष्टि के लिए संदर्भ विधि बन गया, और 2020 की शुरुआत में मान्य परख के तेजी से प्रकाशन ने आणविक परीक्षण के वैश्विक विस्तार को सक्षम किया, यह दर्शाता है कि न्यूक्लिक-एसिड प्रवर्धन प्रकोप का पता लगाने और निगरानी को कैसे रेखांकित करता है।

History

पॉलीमरेज़ चेन रिएक्शन की कल्पना कैरी मुलिस ने की थी और पहली बार 1985 में सैकी और सहयोगियों द्वारा आनुवंशिक निदान के लिए लागू किया गया था, जिसमें 1987 में मुलिस और फालूना द्वारा विधि को औपचारिक रूप दिया गया था। 1996 में हेड और सहयोगियों द्वारा वर्णित वास्तविक समय मात्रात्मक पीसीआर ने निरंतर परिमाणीकरण जोड़ा, और 2000 में नोतोमी और सहयोगियों द्वारा पेश किए गए लूप-मध्यस्थ प्रवर्धन जैसी समतापी विधियों ने प्रवर्धन कहाँ किया जा सकता है, इसका विस्तार किया।

Key figures

• Kary Mullis
• Randall Saiki
• Christian Drosten

Seminal works

• saiki-1985
• mullis-faloona-1987
• heid-1996
• corman-2020

Frequently asked questions

पीसीआर और आरटी-पीसीआर में क्या अंतर है?

पीसीआर डीएनए को प्रवर्धित करता है, इसलिए इसका उपयोग सीधे डीएनए वायरस के लिए किया जाता है। आरटी-पीसीआर एक रिवर्स-ट्रांसक्रिप्शन चरण जोड़ता है जो वायरस के आरएनए जीनोम को पहले पूरक डीएनए में परिवर्तित करता है, जिससे इन्फ्लूएंजा और कोरोनावायरस जैसे आरएनए वायरस का पता लगाया जा सकता है।

क्या सकारात्मक पीसीआर परिणाम का मतलब संक्रामक वायरस मौजूद है?

आवश्यक नहीं। पीसीआर वायरल जीनोम का पता लगाता है, जो वायरस के प्रतिकृति या संक्रामक न होने के बाद भी बना रह सकता है। संक्रामक वायरस की उपस्थिति स्थापित करने के लिए नैदानिक ​​संदर्भ में व्याख्या की गई संस्कृति या अन्य कार्यात्मक परख की आवश्यकता होती है।