आरएनए अनुक्रमण और प्रतिलेखन विज्ञान

आरएनए अनुक्रमण (RNA-seq) उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण द्वारा एक नमूने में आरएनए अणुओं की पहचान और प्रचुरता निर्धारित करता है, जिससे जीन अभिव्यक्ति का एक मात्रात्मक, जीनोम-व्यापी चित्र मिलता है। प्रतिलेखन विज्ञान (ट्रांसक्रिप्टोमिक्स) प्रतिलेखों के इस पूर्ण सेट, जिसे ट्रांसक्रिप्टोम कहते हैं, और यह ऊतकों, स्थितियों और रोग अवस्थाओं के बीच कैसे बदलता है, का अध्ययन है।

Definition

आरएनए अनुक्रमण एक ऐसी विधि है जो आरएनए को अनुक्रमित खंडों की एक लाइब्रेरी में परिवर्तित करती है और ट्रांसक्रिप्टोम, जो एक कोशिका या ऊतक में मौजूद आरएनए अणुओं का पूरा सेट है, में अभिव्यक्ति को मापने के लिए जीनों या प्रतिलेखों से मैप किए गए रीड्स की गणना करती है।

Scope

यह विषय बताता है कि आरएनए-सीक्वेंस रीड्स को अभिव्यक्ति अनुमानों में कैसे बदलता है, एक गतिशील रीडआउट के रूप में ट्रांसक्रिप्टोम का अर्थ, सामान्य मात्रा निर्धारण इकाइयाँ, और अनुक्रमण-आधारित माप के लिए विशिष्ट गुणवत्ता और मानकीकरण के मुद्दे। यह आरएनए-सीक्वेंस को एक नैदानिक परीक्षण प्रोटोकॉल के बजाय एक माप और खोज मंच के रूप में मानता है।

Core questions

• अनुक्रमण रीड्स को मात्रात्मक अभिव्यक्ति अनुमानों में कैसे परिवर्तित किया जाता है?
• ट्रांसक्रिप्टोम जीनों की एक निश्चित सूची से परे क्या कैप्चर करता है?
• सामान्यीकरण और रीड गहराई तुलनीयता को कैसे प्रभावित करते हैं?
• आरएनए-सीक्वेंस की सटीकता और पुनरुत्पादन क्षमता का आकलन कैसे किया जाता है?

Key concepts

• ट्रांसक्रिप्टोम
• रीड मैपिंग और गणना
• सामान्यीकरण (जैसे गहराई और लंबाई स्केलिंग)
• विभेदक अभिव्यक्ति
• स्पाइक-इन नियंत्रण
• एकल-कोशिका और बल्क ट्रांसक्रिप्टोमिक्स

Mechanisms

आरएनए को निकाला जाता है, सीडीएनए में रिवर्स-ट्रांसक्राइब किया जाता है, खंडित किया जाता है, और एक अनुक्रमण लाइब्रेरी में तैयार किया जाता है; परिणामी रीड्स को एक संदर्भ जीनोम या ट्रांसक्रिप्टोम के साथ संरेखित किया जाता है, और प्रत्येक विशेषता को ओवरलैप करने वाले रीड्स की संख्या इसकी अभिव्यक्ति के आनुपातिक गणना प्रदान करती है (Mortazavi et al., 2008)। चूंकि कुल रीड गहराई और प्रतिलेख लंबाई कच्चे काउंट्स को प्रभावित करती है, इसलिए प्रतिलेखों की तुलना करने से पहले डेटा को सामान्यीकृत किया जाता है, और प्रचुरता को अक्सर लंबाई- और गहराई-स्केल्ड इकाइयों में व्यक्त किया जाता है। आरएनए-सीक्वेंस उपन्यास प्रतिलेखों, स्प्लिस वेरिएंट्स और अभिव्यक्ति की एक विस्तृत गतिशील सीमा का पता लगा सकता है, जो इसे पहले के संकरण-आधारित प्रोफाइलिंग से अलग करता है (Wang et al., 2009)। प्लेटफॉर्म की सटीकता और सीमाओं को चिह्नित करने के लिए बाहरी स्पाइक-इन मानक और कंसोर्टियम बेंचमार्किंग का उपयोग किया जाता है (Jiang et al., 2011; SEQC/MAQC-III Consortium, 2014)।

Clinical relevance

आरएनए-सीक्वेंस तेजी से आणविक ट्यूमर प्रोफाइलिंग, संलयन का पता लगाने और अभिव्यक्ति-आधारित वर्गीकरण का आधार बन रहा है, और ऐसे डेटा की व्याख्या करने के लिए यह समझना आवश्यक है कि काउंट्स अभिव्यक्ति अनुमानों में कैसे बदलते हैं। यह प्रविष्टि विधि और उसके मात्रात्मक गुणों का वर्णन करती है; यह नैदानिक व्याख्या या उपचार मार्गदर्शन प्रदान नहीं करती है, जो मान्य परख और नैदानिक मानदंडों पर आधारित होते हैं।

Evidence & guidelines

आरएनए-सीक्वेंस को एक मात्रात्मक विधि के रूप में वर्णित करने वाले मूलभूत विवरण (Mortazavi et al., 2008; Wang et al., 2009) को सटीकता और पुनरुत्पादन क्षमता पर सामुदायिक प्रयासों द्वारा पूरक किया जाता है, जिसमें बाहरी स्पाइक-इन मानक (Jiang et al., 2011) और आरएनए-सीक्वेंस प्रदर्शन की SEQC/MAQC-III बेंचमार्किंग (2014) शामिल हैं।

History

ट्रांसक्रिप्टोम माप 2000 के दशक के अंत में व्यक्त-अनुक्रम-टैग और माइक्रोएरे दृष्टिकोणों से सीधे अनुक्रमण में चला गया, जब अगली पीढ़ी के अनुक्रमण ने पूरे-ट्रांसक्रिप्टोम रीड काउंटिंग को व्यावहारिक बना दिया (Mortazavi et al., 2008)। आरएनए-सीक्वेंस जल्दी ही अभिव्यक्ति अध्ययनों के लिए एक मानक बन गया, और बाद के कंसोर्टियम कार्य ने इस बात पर ध्यान दिया कि इसके मापों को तुलनीय और पुनरुत्पादित कैसे किया जाए (SEQC/MAQC-III Consortium, 2014)।

Debates

तुलना के लिए आरएनए-सीक्वेंस काउंट्स को कैसे सामान्यीकृत किया जाना चाहिए?

कच्चे काउंट्स अनुक्रमण गहराई और प्रतिलेख लंबाई पर निर्भर करते हैं, और विभिन्न सामान्यीकरण विकल्प यह बदल सकते हैं कि कौन से जीन विभेदक रूप से व्यक्त होते हैं; उपयुक्त सामान्यीकरण और नियंत्रणों का चयन एक कार्यप्रणाली संबंधी चिंता बनी हुई है।

Key figures

• Zhong Wang
• Michael Snyder
• Ali Mortazavi
• Barbara Wold

Seminal works

• wang-2009
• mortazavi-2008
• seqc-2014

Frequently asked questions

ट्रांसक्रिप्टोम क्या है?

ट्रांसक्रिप्टोम किसी दिए गए समय पर एक कोशिका या ऊतक में मौजूद आरएनए प्रतिलेखों का पूरा सेट है; क्योंकि यह स्थिति और कोशिका प्रकार के साथ बदलता है, इसे मापने से पता चलता है कि कौन से जीन सक्रिय हैं और किस स्तर पर।

अभिव्यक्ति के लिए आरएनए-सीक्वेंस माइक्रोएरे से कैसे भिन्न है?

आरएनए-सीक्वेंस सीधे आरएनए का अनुक्रमण और गणना करता है, इसलिए यह उपन्यास प्रतिलेखों और स्प्लिस वेरिएंट्स का पता लगा सकता है और एक विस्तृत गतिशील सीमा को कवर करता है, जबकि माइक्रोएरे पूर्वनिर्धारित जांचों के लिए संकरण को मापते हैं और ज्ञात अनुक्रमों तक सीमित होते हैं।