आणविक निदान: पीसीआर और अनुक्रमण

आणविक विधियाँ कवकों का पता उनके विकास या स्वरूप के बजाय उनके न्यूक्लिक एसिड के माध्यम से लगाती हैं और उनकी पहचान करती हैं। पॉलीमरेज़ चेन रिएक्शन नमूनों या आइसोलेट्स से कवक डीएनए को प्रवर्धित करता है, और संरक्षित क्षेत्रों, विशेष रूप से राइबोसोमल जीन क्लस्टर के आंतरिक ट्रांसक्राइब्ड स्पेसर का अनुक्रमण, प्रवर्धित डीएनए को पढ़कर जीव का नाम बताता है, जो अक्सर कल्चर की तुलना में तेज़ और अधिक सटीक होता है।

Definition

कवकों के लिए आणविक निदान ऐसी तकनीकें हैं जो कवक न्यूक्लिक एसिड को प्रवर्धित और विश्लेषण करती हैं, पीसीआर का उपयोग कवक डीएनए का पता लगाने के लिए करती हैं और आंतरिक ट्रांसक्राइब्ड स्पेसर जैसे संरक्षित क्षेत्रों के डीएनए अनुक्रमण का उपयोग जीव को जीनस या प्रजाति तक पहचानने के लिए करती हैं।

Scope

यह विषय प्रजाति-विशिष्ट और व्यापक-श्रेणी (पैनफंगल) पीसीआर, रियल-टाइम पीसीआर, आईटीएस जैसे बारकोडिंग क्षेत्रों के डीएनए अनुक्रमण, और कल्चर आइसोलेट्स पर तथा सीधे नैदानिक सामग्री, जिसमें फॉर्मेलिन-फिक्स्ड ऊतक भी शामिल है, पर इन विधियों के उपयोग को शामिल करता है। यह इन्हें पहचान और पता लगाने की विधियों के रूप में प्रस्तुत करता है और कोई परीक्षण या उपचार निर्देश प्रदान नहीं करता है।

Core questions

• क्या इस नमूने में कवक डीएनए मौजूद है, और यह किस जीव से आता है?
• प्रजाति-विशिष्ट परख की तुलना में व्यापक-श्रेणी पैनफंगल पीसीआर कब बेहतर है?
• कौन सा जीनोमिक क्षेत्र रुचि के कवकों को सबसे अच्छी तरह से अलग करता है?
• संदूषण और गैर-व्यवहार्य डीएनए का पता लगाने के जोखिमों को देखते हुए आणविक परिणामों की व्याख्या कैसे की जाती है?

Key concepts

• पॉलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर)
• प्रजाति-विशिष्ट बनाम व्यापक-श्रेणी (पैनफंगल) पीसीआर
• रियल-टाइम (मात्रात्मक) पीसीआर
• कवक बारकोड के रूप में आंतरिक ट्रांसक्राइब्ड स्पेसर (आईटीएस)
• डीएनए अनुक्रमण और संदर्भ डेटाबेस
• आइसोलेट्स पर पता लगाना बनाम सीधे ऊतक पर
• संदूषण नियंत्रण और कोशिका-मुक्त डीएनए की व्याख्या

Mechanisms

पीसीआर लक्ष्य डीएनए को बार-बार चक्रों के माध्यम से प्रवर्धित करने के लिए प्राइमर और एक थर्मोस्टेबल पॉलीमरेज़ का उपयोग करता है, जिससे कवक आनुवंशिक सामग्री की थोड़ी मात्रा का भी पता लगाने के लिए पर्याप्त प्रतियां उत्पन्न होती हैं। प्रजाति-विशिष्ट परख एक ज्ञात जीव को लक्षित करते हैं, जबकि व्यापक-श्रेणी या पैनफंगल परख कई कवकों द्वारा साझा किए गए संरक्षित क्षेत्रों के खिलाफ प्राइमर का उपयोग करते हैं, जिसके बाद अनुक्रमण पहचान को प्रकट करता है। राइबोसोमल आरएनए जीन क्लस्टर का आंतरिक ट्रांसक्राइब्ड स्पेसर क्षेत्र, जो व्हाइट और सहयोगियों द्वारा वर्णित संरक्षित प्राइमर से घिरा है, प्रजातियों के बीच इतना परिवर्तनशील है कि यह एक सार्वभौमिक कवक बारकोड के रूप में कार्य कर सकता है, और पढ़ी गई अनुक्रम को जीव का नाम बताने के लिए संदर्भ डेटाबेस के खिलाफ मिलान किया जाता है। रियल-टाइम पीसीआर मात्रा निर्धारण और गति जोड़ता है, और परख कल्चर किए गए आइसोलेट्स पर या सीधे नैदानिक नमूनों पर चलाए जा सकते हैं, जिसमें फॉर्मेलिन-फिक्स्ड ऊतक भी शामिल है, हालांकि डिग्रेडेड डीएनए और पर्यावरणीय संदूषण व्याख्या को जटिल बनाते हैं। क्योंकि पीसीआर व्यवहार्य कोशिकाओं के बजाय डीएनए का पता लगाता है, परिणामों को कल्चर, माइक्रोस्कोपी और एंटीजन निष्कर्षों के साथ पढ़ा जाता है।

Clinical relevance

आणविक पहचान और अनुक्रमण तेजी से इस बात का आधार बन रहे हैं कि कवकों की पहचान कैसे की जाती है और कुछ संक्रमणों को कैसे पहचाना जाता है, और कुछ पीसीआर परिणाम संभावित आक्रामक कवक रोग की आम सहमति श्रेणियों में योगदान करते हैं। यह प्रविष्टि संदर्भ सामग्री के रूप में विधियों और उनकी व्याख्यात्मक चेतावनियों का वर्णन करती है और परीक्षण या रोगी देखभाल को निर्देशित नहीं करती है।

Evidence & guidelines

EORTC/MSGERC से आम सहमति परिभाषाएँ संभावित आक्रामक कवक रोग के लिए माइकोलॉजिकल मानदंडों में निर्दिष्ट पीसीआर परिणामों को शामिल करती हैं, जो आणविक विधियों के परिपक्वता को दर्शाती हैं, जबकि सर्वोत्तम-अभ्यास सिफारिशें कल्चर और एंटीजन परीक्षण के साथ उनके स्थान का वर्णन करती हैं। आईटीएस अनुक्रमण दृष्टिकोण व्हाइट और सहयोगियों द्वारा प्रकाशित व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले प्राइमर से जुड़ा है।

History

1980 के दशक में पॉलीमरेज़ चेन रिएक्शन विकसित होने के बाद, कवकों पर इसका अनुप्रयोग तेजी से आगे बढ़ा जब व्हाइट और सहयोगियों ने 1990 में कवक राइबोसोमल आरएनए जीन को प्रवर्धित करने और सीधे अनुक्रमण के लिए प्राइमर प्रकाशित किए, जिससे आईटीएस क्षेत्र एक फाइलोजेनेटिक और बाद में नैदानिक मार्कर के रूप में स्थापित हुआ। रियल-टाइम पीसीआर, व्यापक-श्रेणी पैनफंगल परख, और उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण ने बाद में आणविक माइकोलॉजी को अनुसंधान से नियमित पहचान और पता लगाने तक विस्तारित किया।

Seminal works

• white-1990
• donnelly-2020

Frequently asked questions

आईटीएस क्षेत्र क्या है और इसका उपयोग कवकों की पहचान के लिए क्यों किया जाता है?

आंतरिक ट्रांसक्राइब्ड स्पेसर (आईटीएस) कवक राइबोसोमल जीन क्लस्टर का एक हिस्सा है जो संरक्षित अनुक्रमों से घिरा होने के साथ-साथ प्रजातियों के बीच पर्याप्त रूप से भिन्न होता है, जिससे यह अनुक्रमण-आधारित कवक पहचान के लिए एक व्यावहारिक सार्वभौमिक बारकोड बन जाता है।

क्या सकारात्मक कवक पीसीआर सक्रिय संक्रमण को साबित करता है?

अपने आप में नहीं। पीसीआर कवक डीएनए का पता लगाता है, जो जीवों के व्यवहार्य न होने के बाद भी बना रह सकता है या संदूषण से उत्पन्न हो सकता है, इसलिए आणविक परिणामों की व्याख्या कल्चर, माइक्रोस्कोपी और एंटीजन परीक्षणों के साथ और मानकीकृत नैदानिक परिभाषाओं के भीतर की जाती है।