वास्तविक-समय मात्रात्मक विश्लेषण और प्रतिलिपि संख्या निर्धारण

मात्रात्मक आणविक विधियाँ यह नहीं मापतीं कि कोई लक्ष्य न्यूक्लिक अम्ल पता लगाने योग्य है या नहीं, बल्कि यह मापती हैं कि वह कितनी मात्रा में मौजूद है। वास्तविक-समय मात्रात्मक पीसीआर प्रवर्धन को उसी समय ट्रैक करता है जब वह होता है, डिजिटल पीसीआर अणुओं को बिल्कुल गिनने के लिए एक नमूने को विभाजित करता है, और प्रतिलिपि संख्या निर्धारण यह निर्धारित करता है कि एक जीनोमिक क्षेत्र प्राप्त हुआ है या खो गया है।

Definition

वास्तविक-समय मात्रात्मक विश्लेषण एक लक्ष्य न्यूक्लिक अम्ल की मात्रा को मापता है, आमतौर पर प्रवर्धन (वास्तविक-समय पीसीआर) के दौरान प्रतिदीप्ति संकेत की निगरानी करके या सकारात्मक विभाजनों (डिजिटल पीसीआर) की गणना करके; प्रतिलिपि संख्या निर्धारण एक संदर्भ के सापेक्ष एक जीनोमिक क्षेत्र की प्रतियों की संख्या निर्धारित करता है।

Scope

यह विषय वास्तविक-समय (मात्रात्मक) पीसीआर, डिजिटल और ड्रॉपलेट डिजिटल पीसीआर, और प्रतिलिपि संख्या निर्धारण के दृष्टिकोणों को शामिल करता है। यह मात्रा निर्धारण के सिद्धांतों और उन विचारों को संबोधित करता है जो परिणामों को तुलनीय बनाते हैं, जिन्हें नैदानिक परीक्षण मार्गदर्शन के बजाय कार्यप्रणाली संदर्भ सामग्री के रूप में प्रस्तुत किया गया है।

Key concepts

• वास्तविक-समय (मात्रात्मक) पीसीआर
• मात्रा निर्धारण चक्र (Cq) और प्रवर्धन दक्षता
• मानक वक्र और सापेक्ष मात्रा निर्धारण
• डिजिटल और ड्रॉपलेट डिजिटल पीसीआर
• विभाजन द्वारा पूर्ण मात्रा निर्धारण
• प्रतिलिपि संख्या लाभ और हानि
• रिपोर्टिंग मानक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्यता

Mechanisms

वास्तविक-समय पीसीआर प्रवर्धन को एक प्रतिदीप्ति रिपोर्टर से जोड़ता है जिसका संकेत उत्पाद संचय के अनुपात में बढ़ता है; जिस चक्र पर संकेत एक सीमा को पार करता है वह लक्ष्य की प्रारंभिक मात्रा को दर्शाता है, जिससे सापेक्ष या मानक-वक्र मात्रा निर्धारण की अनुमति मिलती है (Heid et al., 1996)। डिजिटल पीसीआर इसके बजाय नमूने को कई छोटे विभाजनों में वितरित करता है ताकि प्रत्येक में शून्य या कुछ अणु हों; सकारात्मक विभाजनों के अंश की गणना करना और पॉइसन सांख्यिकी लागू करना एक मानक वक्र के बिना एक पूर्ण गणना देता है (Hindson et al., 2011)। प्रतिलिपि संख्या निर्धारण प्रवर्धन या विलोपन का पता लगाने के लिए एक लक्ष्य क्षेत्र की प्रचुरता की तुलना एक संदर्भ से करता है, एक विचार जिसे तुलनात्मक जीनोमिक संकरण (Kallioniemi et al., 1992) द्वारा अग्रणी किया गया था।

Clinical relevance

मात्रात्मक और प्रतिलिपि संख्या विधियों का उपयोग रोगजनक भार, जीन अभिव्यक्ति और जीनोमिक लाभ या हानि को मापने के लिए किया जाता है। यह प्रविष्टि बताती है कि मात्रा निर्धारण एक कार्यप्रणाली संदर्भ के रूप में कैसे काम करता है; यह रोगी देखभाल में किसी विशिष्ट मात्रात्मक परख के चयन, व्याख्या या उस पर कार्रवाई करने की सलाह नहीं देता है।

Evidence & guidelines

मात्रात्मक पीसीआर की रिपोर्टिंग MIQE सिफारिशों द्वारा निर्देशित होती है, जो प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रकाशन के लिए आवश्यक न्यूनतम जानकारी निर्दिष्ट करती हैं (Bustin et al., 2009)। मूलभूत प्राथमिक अध्ययन वास्तविक-समय मात्रा निर्धारण (Heid et al., 1996), पूर्ण डिजिटल मात्रा निर्धारण (Hindson et al., 2011), और जीनोम-व्यापी प्रतिलिपि संख्या माप (Kallioniemi et al., 1992) का वर्णन करते हैं।

History

1990 के दशक के मध्य में वास्तविक-समय पीसीआर ने प्रवर्धन को एक गुणात्मक से मात्रात्मक उपकरण में बदल दिया (Heid et al., 1996), और एक दशक बाद आम सहमति रिपोर्टिंग मानक आए (Bustin et al., 2009)। डिजिटल पीसीआर, और विशेष रूप से ड्रॉपलेट डिजिटल पीसीआर, ने तब उच्च सटीकता के साथ अणुओं की पूर्ण गणना को सक्षम किया (Hindson et al., 2011), जबकि प्रतिलिपि संख्या निर्धारण तुलनात्मक जीनोमिक संकरण से सरणी- और अनुक्रमण-आधारित विधियों की ओर विकसित हुआ (Kallioniemi et al., 1992)।

Key figures

• Christian Heid
• Stephen Bustin
• Benjamin Hindson

Seminal works

• heid-1996
• hindson-2011
• bustin-2009

Frequently asked questions

डिजिटल पीसीआर वास्तविक-समय मात्रात्मक पीसीआर से कैसे भिन्न है?

वास्तविक-समय पीसीआर लक्ष्य की प्रारंभिक मात्रा का अनुमान इस बात से लगाता है कि प्रतिदीप्ति संकेत कितनी जल्दी एक सीमा को पार करता है, आमतौर पर एक मानक के सापेक्ष, जबकि डिजिटल पीसीआर नमूने को विभाजित करता है और एक मानक वक्र के बिना एक पूर्ण अणु गणना देने के लिए सकारात्मक डिब्बों की गणना करता है।

प्रतिलिपि संख्या निर्धारण क्या मापता है?

यह निर्धारित करता है कि एक विशेष जीनोमिक क्षेत्र की कितनी प्रतियां एक संदर्भ के सापेक्ष मौजूद हैं, उस क्षेत्र के प्रवर्धन (लाभ) या विलोपन (हानि) की पहचान करता है।