पीसीआर और न्यूक्लिक एसिड प्रवर्धन तकनीकें

न्यूक्लिक एसिड प्रवर्धन तकनीकें एक चुने हुए डीएनए या आरएनए अनुक्रम को कई बार कॉपी करती हैं ताकि बहुत कम मात्रा में मौजूद लक्ष्य का पता लगाया जा सके और उसे मापा जा सके। पॉलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) इसका मूलरूप है: विनेत्रीकरण (denaturation), प्राइमर एनीलिंग (primer annealing), और पॉलीमरेज़ एक्सटेंशन (polymerase extension) के दोहराए गए चक्रों के माध्यम से, यह एक परिभाषित अनुक्रम में घातीय वृद्धि उत्पन्न करता है, जिससे यह आणविक निदान की आधारशिला बन जाता है।

Definition

न्यूक्लिक एसिड प्रवर्धन तकनीकें इन विट्रो (in vitro) विधियाँ हैं जो एक विशिष्ट डीएनए या आरएनए अनुक्रम की कई प्रतियों को एंजाइमी रूप से उत्पन्न करती हैं, जिसमें पीसीआर थर्मल साइक्लिंग और एक डीएनए पॉलीमरेज़ का उपयोग करके दो प्राइमरों द्वारा परिभाषित एक क्षेत्र को प्रवर्धित करता है।

Scope

यह विषय पारंपरिक एंड-पॉइंट पीसीआर, रियल-टाइम (मात्रात्मक) पीसीआर, आरएनए लक्ष्यों के लिए रिवर्स-ट्रांसक्रिप्शन पीसीआर, और लूप-मध्यस्थ समतापी प्रवर्धन (loop-mediated isothermal amplification) जैसे समतापी विकल्पों को शामिल करता है। यह प्रवर्धन के सिद्धांतों, घटकों और रिपोर्टिंग विचारों को एक कार्यप्रणाली संदर्भ के रूप में संबोधित करता है, न कि परख प्रोटोकॉल या नैदानिक मार्गदर्शन के रूप में।

Key concepts

• थर्मल साइक्लिंग (विनेत्रीकरण, एनीलिंग, एक्सटेंशन)
• प्राइमर और डीएनए पॉलीमरेज़
• घातीय प्रवर्धन
• आरएनए लक्ष्यों के लिए रिवर्स-ट्रांसक्रिप्शन पीसीआर
• रियल-टाइम (मात्रात्मक) पीसीआर
• समतापी प्रवर्धन (जैसे, LAMP)
• संदूषण नियंत्रण और गलत सकारात्मक

Mechanisms

पीसीआर में, डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए को गर्मी से एकल स्ट्रैंड में विनेत्रित किया जाता है, छोटे ओलिगोन्यूक्लियोटाइड प्राइमर लक्ष्य के किनारे के अनुक्रमों से जुड़ते हैं, और एक थर्मोस्टेबल डीएनए पॉलीमरेज़ नए पूरक स्ट्रैंड्स को संश्लेषित करने के लिए प्राइमरों का विस्तार करता है; चक्र को दोहराने से प्रत्येक दौर में लक्ष्य दोगुना हो जाता है, जिससे घातीय प्रवर्धन होता है (सैकी एट अल., 1985; मुलिस एट अल., 1986)। आरएनए लक्ष्यों को प्रवर्धन से पहले रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज़ द्वारा पहले पूरक डीएनए में परिवर्तित किया जाता है। रियल-टाइम पीसीआर फ्लोरोसेंट रिपोर्टर का उपयोग करके चक्र दर चक्र उत्पाद संचय की निगरानी करता है, जिससे मात्रा का निर्धारण संभव होता है (हेइड एट अल., 1996)। लूप-मध्यस्थ समतापी प्रवर्धन जैसी समतापी विधियाँ एक ही तापमान पर प्रवर्धित होती हैं, जिससे थर्मल साइक्लिंग की आवश्यकता समाप्त हो जाती है (नोटोमी एट अल., 2000)।

Clinical relevance

प्रवर्धन तकनीकों का व्यापक रूप से निदान प्रयोगशालाओं में रोगजनकों का पता लगाने और आनुवंशिक लक्ष्यों की विशेषता बताने के लिए उपयोग किया जाता है। यह प्रविष्टि बताती है कि प्रवर्धन कैसे काम करता है और इसके प्रदर्शन की रिपोर्ट कैसे की जाती है; यह एक कार्यप्रणाली संदर्भ है और रोगी देखभाल में किसी विशेष परीक्षण को ऑर्डर करने या उसकी व्याख्या करने के लिए मार्गदर्शन प्रदान नहीं करता है।

Evidence & guidelines

एमआईक्यूई (MIQE) दिशानिर्देश (बस्टिन एट अल., 2009) मात्रात्मक रियल-टाइम पीसीआर प्रयोगों की रिपोर्ट करने के लिए आवश्यक न्यूनतम जानकारी निर्धारित करते हैं और पारदर्शिता और पुनरुत्पादन क्षमता के लिए एक व्यापक रूप से उद्धृत संदर्भ हैं। मूलभूत प्राथमिक अध्ययन मूल पीसीआर विधि और रियल-टाइम मात्रा निर्धारण का वर्णन करते हैं (सैकी एट अल., 1985; हेइड एट अल., 1996), जबकि बाद के काम ने समतापी विकल्पों को पेश किया (नोटोमी एट अल., 2000)।

History

पीसीआर की कल्पना कैरी मुलिस ने की थी और पहली बार 1985 में सैकी और उनके सहयोगियों द्वारा एक नैदानिक समस्या — सिकल-सेल उत्परिवर्तन का पता लगाने — पर लागू किया गया था, जिसमें विधि का औपचारिक रूप से 1986 में वर्णन किया गया था (सैकी एट अल., 1985; मुलिस एट अल., 1986)। थर्मोस्टेबल पॉलीमरेज़ की शुरुआत ने प्रक्रिया को स्वचालित किया, और 1990 के दशक में रियल-टाइम डिटेक्शन ने मात्रात्मक क्षमता जोड़ी (हेइड एट अल., 1996)। समतापी तकनीकों ने बाद में थर्मल साइक्लर के बिना सेटिंग्स में प्रवर्धन को व्यापक बनाया (नोटोमी एट अल., 2000)।

Key figures

• Kary Mullis
• Randall Saiki
• Henry Erlich

Seminal works

• saiki-1985
• heid-1996
• bustin-2009

Frequently asked questions

पीसीआर एक लक्ष्य को घातीय रूप से क्यों प्रवर्धित करता है?

प्रत्येक चक्र लक्ष्य के प्रत्येक मौजूदा स्ट्रैंड की प्रतिलिपि बनाता है, इसलिए प्रतियों की संख्या प्रत्येक दौर में लगभग दोगुनी हो जाती है; कई चक्रों के बाद कुछ अणुओं के रूप में शुरू हुआ एक अनुक्रम अरबों प्रतियों तक पहुंच सकता है।

समतापी प्रवर्धन पीसीआर से कैसे भिन्न है?

लूप-मध्यस्थ समतापी प्रवर्धन जैसी समतापी विधियाँ विशेष प्राइमरों और एंजाइमों का उपयोग करके एक ही स्थिर तापमान पर डीएनए को प्रवर्धित करती हैं, जिससे पारंपरिक पीसीआर के लिए आवश्यक बार-बार हीटिंग और कूलिंग चक्रों की आवश्यकता समाप्त हो जाती है।