Applications de la PCR en temps réel et de la PCR quantitative

La PCR en temps réel, également appelée PCR quantitative (qPCR), mesure l'accumulation d'ADN amplifié cycle par cycle via un signal fluorescent, permettant d'estimer la quantité initiale d'une séquence cible. Combinée à la transcription inverse (RT-qPCR), elle constitue l'une des méthodes les plus couramment utilisées pour quantifier l'expression génique en pathologie moléculaire.

Definition

La PCR quantitative en temps réel est une méthode d'amplification des acides nucléiques qui surveille la formation du produit en temps réel via la fluorescence, utilisant le cycle de quantification pour estimer la quantité initiale d'une cible d'ADN ou (après transcription inverse) d'ARN.

Scope

Ce sujet aborde le principe de mesure de la PCR en temps réel, le cycle de quantification (Cq) et sa relation avec la quantité de matrice, la quantification relative par la méthode comparative 2-DDCT, le rôle des gènes de référence et de l'efficacité d'amplification, ainsi que les normes de rapport qui régissent la reproductibilité. Il mentionne également la PCR digitale comme une approche de quantification absolue apparentée. Il traite de ces méthodes comme des techniques de laboratoire, et non comme des protocoles de tests cliniques.

Core questions

• Comment le cycle de quantification est-il lié à la quantité de matrice initiale ?
• Comment l'expression relative est-elle calculée et normalisée en RT-qPCR ?
• Pourquoi l'efficacité d'amplification et le choix du gène de référence affectent-ils le résultat ?
• En quoi la PCR digitale diffère-t-elle de la PCR en temps réel pour la quantification ?

Key concepts

• Cycle de quantification (Cq / Ct)
• Efficacité d'amplification
• Méthode comparative 2-DDCT
• Gènes de référence (ménagers)
• PCR quantitative à transcription inverse
• PCR digitale et partitionnement
• Normes de rapport MIQE

Mechanisms

Pendant la PCR, la séquence cible double à chaque cycle dans la phase exponentielle, et un rapporteur fluorescent (un colorant intercalant ou une sonde spécifique à une séquence) émet un signal proportionnel au produit accumulé. Le cycle auquel la fluorescence franchit un seuil défini (le cycle de quantification, Cq ou Ct) est inversement lié au logarithme de la quantité de matrice initiale, ainsi, un Cq plus faible indique une plus grande quantité de cible. L'expression relative est le plus souvent calculée avec la méthode comparative 2-DDCT, qui normalise le Cq de la cible par rapport à un gène de référence et à un échantillon calibrateur, en supposant des efficacités d'amplification quasi égales (Livak & Schmittgen, 2001). Étant donné que l'efficacité, la stabilité des gènes de référence et la variabilité de la transcription inverse affectent tous l'estimation, les directives MIQE spécifient les détails expérimentaux et la validation nécessaires pour qu'un résultat soit interprétable (Bustin et al., 2009). La PCR digitale, quant à elle, partitionne l'échantillon en de nombreuses réactions et compte les partitions positives, offrant une quantification absolue sans courbe standard (Huggett et al., 2013).

Clinical relevance

La RT-qPCR est une plateforme courante pour mesurer les niveaux de transcrits sous-jacents aux résultats diagnostiques et pronostiques moléculaires, et la compréhension de ses hypothèses fait partie de l'interprétation des rapports de laboratoire. Cette entrée explique la méthode et ses limites et ne constitue pas une base pour les seuils diagnostiques ou la prise en charge des patients, qui dépendent d'essais validés.

Evidence & guidelines

Les attentes en matière de rapport et de qualité pour la PCR en temps réel sont énoncées dans les directives MIQE (Bustin et al., 2009) et, pour la PCR digitale, dans les directives MIQE digitales (Huggett et al., 2013). La méthode comparative 2-DDCT (Livak & Schmittgen, 2001) reste la référence standard pour la quantification relative.

History

La PCR en temps réel est apparue dans les années 1990 lorsque la détection fluorescente a été couplée au cyclage thermique, remplaçant la quantification au point final, qui était laborieuse. La méthode comparative 2-DDCT (2001) a standardisé la quantification relative, les directives MIQE (2009) ont abordé les problèmes généralisés de reproductibilité, et la PCR digitale a ensuite étendu le domaine vers la quantification absolue.

Debates

Comment les gènes de référence doivent-ils être choisis pour la normalisation ?

La quantification relative suppose une expression stable des gènes de référence dans toutes les conditions, mais les gènes ménagers uniques peuvent varier ; l'utilisation de plusieurs gènes de référence validés est recommandée pour éviter une normalisation biaisée.

Key figures

• Stephen Bustin
• Kenneth Livak
• Thomas Schmittgen
• Jim Huggett

Seminal works

• livak-2001
• bustin-2009
• huggett-2013

Frequently asked questions

Que signifie une valeur de Ct plus basse ?

Un cycle de quantification (Ct ou Cq) plus bas signifie que la fluorescence franchit le seuil plus tôt, ce qui indique une plus grande quantité de matrice cible initiale ; le Ct est inversement lié au logarithme de la quantité initiale.

En quoi la PCR digitale diffère-t-elle de la qPCR en temps réel ?

La PCR digitale partitionne la réaction en de nombreux petits compartiments et compte combien contiennent la cible, donnant un dénombrement absolu sans courbe standard, tandis que la qPCR en temps réel déduit la quantité du cycle de quantification, généralement comme une mesure relative.