Diagnostic moléculaire : PCR et séquençage

Les méthodes moléculaires détectent et identifient les champignons par leurs acides nucléiques plutôt que par leur croissance ou leur apparence. La réaction en chaîne par polymérase (PCR) amplifie l'ADN fongique à partir d'échantillons ou d'isolats, et le séquençage des régions conservées, en particulier l'espaceur transcrit interne (ITS) du groupe de gènes ribosomiques, permet de lire l'ADN amplifié pour nommer l'organisme, souvent plus rapidement et plus précisément que la culture.

Definition

Le diagnostic moléculaire des champignons regroupe des techniques qui amplifient et analysent les acides nucléiques fongiques, utilisant la PCR pour détecter l'ADN fongique et le séquençage de l'ADN de régions conservées telles que l'espaceur transcrit interne (ITS) pour identifier l'organisme au niveau du genre ou de l'espèce.

Scope

Ce sujet couvre la PCR spécifique à l'espèce et à large spectre (panfongique), la PCR en temps réel, le séquençage de l'ADN des régions de code-barres telles que l'ITS, ainsi que l'utilisation de ces méthodes sur des isolats de culture et directement sur des échantillons cliniques, y compris les tissus fixés au formol. Il les présente comme des méthodes d'identification et de détection et n'offre aucune instruction de test ou de traitement.

Core questions

• L'ADN fongique est-il présent dans cet échantillon, et de quel organisme provient-il ?
• Quand la PCR panfongique à large spectre est-elle préférable à un test spécifique à l'espèce ?
• Quelle région génomique discrimine le mieux les champignons d'intérêt ?
• Comment les résultats moléculaires sont-ils interprétés compte tenu des risques de contamination et de détection d'ADN non viable ?

Key concepts

• Réaction en chaîne par polymérase (PCR)
• PCR spécifique à l'espèce versus PCR à large spectre (panfongique)
• PCR en temps réel (quantitative)
• Espaceur transcrit interne (ITS) comme code-barres fongique
• Séquençage de l'ADN et bases de données de référence
• Détection sur isolats versus détection directe sur tissu
• Contrôle de la contamination et interprétation de l'ADN acellulaire

Mechanisms

La PCR utilise des amorces et une polymérase thermostable pour amplifier l'ADN cible par cycles répétés, générant suffisamment de copies pour détecter même de petites quantités de matériel génétique fongique. Les tests spécifiques à l'espèce ciblent un organisme connu, tandis que les tests à large spectre ou panfongiques utilisent des amorces contre des régions conservées partagées par de nombreux champignons, après quoi le séquençage révèle l'identité. La région de l'espaceur transcrit interne (ITS) du groupe de gènes de l'ARN ribosomal, flanquée d'amorces conservées décrites par White et ses collègues, est suffisamment variable entre les espèces pour servir de code-barres fongique universel, et la séquence lue est comparée à des bases de données de référence pour nommer l'organisme. La PCR en temps réel ajoute la quantification et la rapidité, et les tests peuvent être effectués sur des isolats cultivés ou directement sur des échantillons cliniques, y compris les tissus fixés au formol, bien que l'ADN dégradé et la contamination environnementale compliquent l'interprétation. Étant donné que la PCR détecte l'ADN plutôt que les cellules viables, les résultats sont interprétés conjointement avec les cultures, la microscopie et les résultats d'antigènes.

Clinical relevance

La détection moléculaire et le séquençage sont de plus en plus à la base de l'identification des champignons et de la reconnaissance de certaines infections, et certains résultats de PCR contribuent aux catégories consensuelles de maladie fongique invasive probable. Cette entrée décrit les méthodes et leurs mises en garde interprétatives comme matériel de référence et n'oriente ni les tests ni les soins aux patients.

Evidence & guidelines

Les définitions consensuelles de l'EORTC/MSGERC intègrent des résultats de PCR spécifiés parmi les critères mycologiques de maladie fongique invasive probable, reflétant la maturation des méthodes moléculaires, tandis que les recommandations de bonnes pratiques décrivent leur place aux côtés de la culture et des tests antigéniques. L'approche de séquençage de l'ITS remonte aux amorces largement utilisées publiées par White et ses collègues.

History

Après le développement de la réaction en chaîne par polymérase dans les années 1980, son application aux champignons a rapidement progressé lorsque White et ses collègues ont publié, en 1990, des amorces pour amplifier et séquencer directement les gènes de l'ARN ribosomal fongique, établissant la région ITS comme marqueur phylogénétique puis diagnostique. La PCR en temps réel, les tests panfongiques à large spectre et le séquençage à haut débit ont ensuite étendu la mycologie moléculaire de la recherche à l'identification et à la détection de routine.

Seminal works

• white-1990
• donnelly-2020

Frequently asked questions

Qu'est-ce que la région ITS et pourquoi est-elle utilisée pour identifier les champignons ?

L'espaceur transcrit interne (ITS) est une partie du groupe de gènes ribosomiques fongiques qui varie suffisamment entre les espèces tout en étant flanquée de séquences conservées, ce qui en fait un code-barres universel pratique pour l'identification fongique basée sur le séquençage.

Une PCR fongique positive prouve-t-elle une infection active ?

Pas à elle seule. La PCR détecte l'ADN fongique, qui peut persister après que les organismes ne sont plus viables ou provenir d'une contamination. Les résultats moléculaires sont donc interprétés conjointement avec les cultures, la microscopie et les tests antigéniques, et dans le cadre de définitions diagnostiques standardisées.