Analyse quantitative en temps réel et évaluation du nombre de copies

Les méthodes moléculaires quantitatives mesurent la quantité d'un acide nucléique cible présent, plutôt que de simplement déterminer s'il est détectable. La PCR quantitative en temps réel suit l'amplification au fur et à mesure qu'elle se produit, la PCR numérique partitionne un échantillon pour compter les molécules de manière absolue, et l'évaluation du nombre de copies détermine si une région génomique est gagnée ou perdue.

Definition

L'analyse quantitative en temps réel mesure la quantité d'un acide nucléique cible, généralement en surveillant le signal fluorescent pendant l'amplification (PCR en temps réel) ou en comptant les partitions positives (PCR numérique) ; l'évaluation du nombre de copies détermine le nombre de copies d'une région génomique par rapport à une référence.

Scope

Ce sujet couvre la PCR en temps réel (quantitative), la PCR numérique et la PCR numérique en gouttelettes, ainsi que les approches d'évaluation du nombre de copies. Il aborde les principes de la quantification et les considérations qui rendent les résultats comparables, présenté comme un matériel de référence méthodologique plutôt que comme un guide de tests cliniques.

Key concepts

• PCR en temps réel (quantitative)
• Cycle de quantification (Cq) et efficacité d'amplification
• Courbes standard et quantification relative
• PCR numérique et PCR numérique en gouttelettes
• Quantification absolue par partitionnement
• Gains et pertes du nombre de copies
• Normes de publication et reproductibilité

Mechanisms

La PCR en temps réel couple l'amplification à un rapporteur fluorescent dont le signal augmente proportionnellement à l'accumulation du produit ; le cycle auquel le signal franchit un seuil reflète la quantité initiale de la cible, permettant une quantification relative ou par courbe standard (Heid et al., 1996). La PCR numérique distribue plutôt l'échantillon dans de nombreuses petites partitions de sorte que chacune contient zéro ou quelques molécules ; le comptage de la fraction de partitions positives et l'application des statistiques de Poisson donnent un dénombrement absolu sans courbe standard (Hindson et al., 2011). L'évaluation du nombre de copies compare l'abondance d'une région cible à une référence pour détecter les amplifications ou les délétions, une idée initiée par l'hybridation génomique comparative (Kallioniemi et al., 1992).

Clinical relevance

Les méthodes quantitatives et d'évaluation du nombre de copies sont utilisées pour mesurer la charge pathogène, l'expression génique et les gains ou pertes génomiques. Cette entrée explique le fonctionnement de la quantification en tant que référence méthodologique ; elle ne fournit pas de conseils sur la sélection, l'interprétation ou l'action concernant un dosage quantitatif spécifique dans le cadre des soins aux patients.

Evidence & guidelines

La publication des résultats de PCR quantitative est guidée par les recommandations MIQE, qui spécifient les informations minimales nécessaires pour une publication reproductible (Bustin et al., 2009). Des études primaires fondamentales décrivent la quantification en temps réel (Heid et al., 1996), la quantification numérique absolue (Hindson et al., 2011), et la mesure du nombre de copies à l'échelle du génome (Kallioniemi et al., 1992).

History

La PCR en temps réel, au milieu des années 1990, a transformé l'amplification d'un outil qualitatif en un outil quantitatif (Heid et al., 1996), et des normes de publication consensuelles ont suivi une décennie plus tard (Bustin et al., 2009). La PCR numérique, et en particulier la PCR numérique en gouttelettes, a ensuite permis le dénombrement absolu de molécules avec une grande précision (Hindson et al., 2011), tandis que l'évaluation du nombre de copies a évolué de l'hybridation génomique comparative vers des méthodes basées sur les puces et le séquençage (Kallioniemi et al., 1992).

Key figures

• Christian Heid
• Stephen Bustin
• Benjamin Hindson

Seminal works

• heid-1996
• hindson-2011
• bustin-2009

Frequently asked questions

En quoi la PCR numérique diffère-t-elle de la PCR quantitative en temps réel ?

La PCR en temps réel estime la quantité initiale de la cible en fonction de la précocité à laquelle le signal fluorescent franchit un seuil, généralement par rapport à un étalon, tandis que la PCR numérique partitionne l'échantillon et compte les compartiments positifs pour donner un nombre absolu de molécules sans courbe standard.

Que mesure l'évaluation du nombre de copies ?

Elle détermine combien de copies d'une région génomique particulière sont présentes par rapport à une référence, identifiant les amplifications (gains) ou les délétions (pertes) de cette région.