PCR et techniques d'amplification des acides nucléiques

Les techniques d'amplification des acides nucléiques copient de nombreuses fois une séquence d'ADN ou d'ARN choisie afin qu'une cible présente en quantités infimes devienne détectable et mesurable. La réaction en chaîne par polymérase (PCR) en est l'archétype : par des cycles répétés de dénaturation, d'hybridation des amorces et d'extension par la polymérase, elle produit une augmentation exponentielle d'une séquence définie, ce qui en fait une pierre angulaire du diagnostic moléculaire.

Definition

Les techniques d'amplification des acides nucléiques sont des méthodes in vitro qui génèrent enzymatiquement de nombreuses copies d'une séquence spécifique d'ADN ou d'ARN, la PCR utilisant des cycles thermiques et une ADN polymérase pour amplifier une région définie par deux amorces.

Scope

Ce sujet couvre la PCR conventionnelle (point final), la PCR en temps réel (quantitative), la PCR par transcription inverse pour les cibles d'ARN, et les alternatives isothermes telles que l'amplification isotherme médiatisée par boucle (LAMP). Il aborde les principes, les composants et les considérations de rapport de l'amplification en tant que référence méthodologique, et non comme des protocoles d'essai ou des directives cliniques.

Key concepts

• Cycles thermiques (dénaturation, hybridation, extension)
• Amorces et ADN polymérase
• Amplification exponentielle
• PCR par transcription inverse pour les cibles d'ARN
• PCR en temps réel (quantitative)
• Amplification isotherme (par exemple, LAMP)
• Contrôle de la contamination et faux positifs

Mechanisms

En PCR, l'ADN double brin est dénaturé par la chaleur en brins simples, de courtes amorces oligonucléotidiques s'hybrident à des séquences flanquant la cible, et une ADN polymérase thermostable étend les amorces pour synthétiser de nouveaux brins complémentaires ; la répétition du cycle double la cible à chaque tour, produisant une amplification exponentielle (Saiki et al., 1985 ; Mullis et al., 1986). Les cibles d'ARN sont d'abord converties en ADN complémentaire par la transcriptase inverse avant l'amplification. La PCR en temps réel surveille l'accumulation du produit cycle par cycle à l'aide de marqueurs fluorescents, permettant la quantification (Heid et al., 1996). Les méthodes isothermes, telles que l'amplification isotherme médiatisée par boucle, amplifient à une seule température, évitant ainsi le besoin de cycles thermiques (Notomi et al., 2000).

Clinical relevance

Les techniques d'amplification sont largement utilisées pour détecter les agents pathogènes et caractériser les cibles génétiques dans les laboratoires de diagnostic. Cette entrée décrit le fonctionnement de l'amplification et la manière dont ses performances sont rapportées ; il s'agit d'une référence méthodologique et ne fournit pas de conseils pour la prescription ou l'interprétation d'un test particulier dans le cadre des soins aux patients.

Evidence & guidelines

Les lignes directrices MIQE (Bustin et al., 2009) définissent les informations minimales nécessaires pour rapporter les expériences de PCR quantitative en temps réel et sont une référence largement citée pour la transparence et la reproductibilité. Des études primaires fondamentales décrivent la méthode PCR originale et la quantification en temps réel (Saiki et al., 1985 ; Heid et al., 1996), tandis que des travaux ultérieurs ont introduit des alternatives isothermes (Notomi et al., 2000).

History

La PCR a été conçue par Kary Mullis et appliquée pour la première fois à un problème de diagnostic — la détection de la mutation de la drépanocytose — par Saiki et ses collègues en 1985, la méthode étant formellement décrite en 1986 (Saiki et al., 1985 ; Mullis et al., 1986). L'introduction de polymérases thermostables a automatisé le processus, et la détection en temps réel dans les années 1990 a ajouté une capacité quantitative (Heid et al., 1996). Les techniques isothermes ont ensuite élargi l'amplification aux environnements sans thermocycleurs (Notomi et al., 2000).

Key figures

• Kary Mullis
• Randall Saiki
• Henry Erlich

Seminal works

• saiki-1985
• heid-1996
• bustin-2009

Frequently asked questions

Pourquoi la PCR amplifie-t-elle une cible de manière exponentielle ?

Chaque cycle copie chaque brin existant de la cible, de sorte que le nombre de copies double approximativement à chaque tour ; après de nombreux cycles, une séquence qui a commencé avec quelques molécules peut atteindre des milliards de copies.

En quoi l'amplification isotherme diffère-t-elle de la PCR ?

Les méthodes isothermes, telles que l'amplification isotherme médiatisée par boucle, amplifient l'ADN à une seule température constante en utilisant des amorces et des enzymes spécialisées, éliminant ainsi le besoin des cycles répétés de chauffage et de refroidissement que la PCR conventionnelle exige.