Séquençage de l'ARN et transcriptomique

Le séquençage de l'ARN (RNA-seq) détermine l'identité et l'abondance des molécules d'ARN dans un échantillon par séquençage à haut débit, offrant une image quantitative et à l'échelle du génome de l'expression génique. La transcriptomique est l'étude de cet ensemble complet de transcrits, le transcriptome, et de la manière dont il varie entre les tissus, les conditions et les états pathologiques.

Definition

Le séquençage de l'ARN est une méthode qui convertit l'ARN en une bibliothèque de fragments séquencés et compte les lectures mappées aux gènes ou aux transcrits pour quantifier l'expression à travers le transcriptome, l'ensemble complet des molécules d'ARN présentes dans une cellule ou un tissu.

Scope

Ce sujet aborde la manière dont le RNA-seq convertit les lectures de séquences en estimations d'expression, la signification du transcriptome en tant que lecture dynamique, les unités de quantification courantes, ainsi que les problèmes de qualité et de standardisation spécifiques aux mesures basées sur le séquençage. Il considère le RNA-seq comme une plateforme de mesure et de découverte plutôt que comme un protocole de test clinique.

Core questions

• Comment les lectures de séquençage sont-elles converties en estimations quantitatives d'expression ?
• Que capture le transcriptome au-delà d'une liste fixe de gènes ?
• Comment la normalisation et la profondeur de lecture affectent-elles la comparabilité ?
• Comment la précision et la reproductibilité du RNA-seq sont-elles évaluées ?

Key concepts

• Transcriptome
• Mappage et décompte des lectures
• Normalisation (par ex. ajustement en fonction de la profondeur et de la longueur)
• Expression différentielle
• Étalons spike-in
• Transcriptomique unicellulaire et en vrac (bulk)

Mechanisms

L'ARN est extrait, rétrotranscrit en ADNc, fragmenté et préparé en une bibliothèque de séquençage ; les lectures résultantes sont alignées sur un génome ou un transcriptome de référence, et le nombre de lectures chevauchant chaque caractéristique fournit un décompte proportionnel à son expression (Mortazavi et al., 2008). Étant donné que la profondeur de lecture totale et la longueur des transcrits influencent les décomptes bruts, les données sont normalisées avant que les transcrits puissent être comparés, et l'abondance est souvent exprimée en unités ajustées en fonction de la longueur et de la profondeur. Le RNA-seq peut détecter de nouveaux transcrits, des variants d'épissage et une large gamme dynamique d'expression, ce qui le distingue des profilages antérieurs basés sur l'hybridation (Wang et al., 2009). Des étalons externes (spike-in standards) et des évaluations comparatives de consortium sont utilisés pour caractériser la précision et les limites de la plateforme (Jiang et al., 2011 ; SEQC/MAQC-III Consortium, 2014).

Clinical relevance

Le RNA-seq est de plus en plus à la base du profilage moléculaire des tumeurs, de la détection de fusions et de la classification basée sur l'expression, et l'interprétation de ces données nécessite de comprendre comment les décomptes deviennent des estimations d'expression. Cette entrée décrit la méthode et ses propriétés quantitatives ; elle ne fournit pas d'interprétations diagnostiques ni de conseils de traitement, qui reposent sur des essais validés et des critères cliniques.

Evidence & guidelines

Les descriptions fondamentales du RNA-seq en tant que méthode quantitative (Mortazavi et al., 2008 ; Wang et al., 2009) sont complétées par les efforts de la communauté sur la précision et la reproductibilité, y compris les étalons externes (spike-in standards) (Jiang et al., 2011) et l'évaluation comparative (benchmarking) des performances du RNA-seq par le consortium SEQC/MAQC-III (2014).

History

La mesure du transcriptome est passée des approches par étiquettes de séquences exprimées (expressed-sequence-tag) et par microréseaux au séquençage direct à la fin des années 2000, lorsque le séquençage de nouvelle génération a rendu pratique le décompte des lectures de l'ensemble du transcriptome (Mortazavi et al., 2008). Le RNA-seq est rapidement devenu une norme pour les études d'expression, et les travaux de consortiums ultérieurs ont abordé la manière de rendre ses mesures comparables et reproductibles (SEQC/MAQC-III Consortium, 2014).

Debates

Comment les décomptes du RNA-seq doivent-ils être normalisés pour la comparaison ?

Les décomptes bruts dépendent de la profondeur de séquençage et de la longueur des transcrits, et différents choix de normalisation peuvent modifier les gènes qui apparaissent comme différentiellement exprimés ; la sélection d'une normalisation et de contrôles appropriés demeure une préoccupation méthodologique.

Key figures

• Zhong Wang
• Michael Snyder
• Ali Mortazavi
• Barbara Wold

Seminal works

• wang-2009
• mortazavi-2008
• seqc-2014

Frequently asked questions

Qu'est-ce que le transcriptome ?

Le transcriptome est l'ensemble complet des transcrits d'ARN présents dans une cellule ou un tissu à un moment donné ; comme il varie en fonction de la condition et du type de cellule, sa mesure indique quels gènes sont actifs et à quel niveau.

En quoi le RNA-seq diffère-t-il des microréseaux pour l'étude de l'expression ?

Le RNA-seq séquence et décompte directement l'ARN, ce qui lui permet de détecter de nouveaux transcrits et des variants d'épissage et de couvrir une large gamme dynamique, tandis que les microréseaux mesurent l'hybridation à des sondes prédéfinies et sont limités aux séquences connues.